微生物检测的生物化学试验汇总!
百欧博伟生物:利用生物化学的方法来检查这些代谢产物以鉴别细菌的方法称为细菌的生物化学试验,简称生化试验。
一、糖类代谢试验
1、糖(醇)类发酵试验
不同细菌含有发酵不同糖(醇)的酶,因而发酵糖(醇)的能力各不相同。即使某些能发酵同样的糖(醇),但其产物也不同,有的产酸产气,有的产酸不产气,可根据这些特点来鉴别细菌。
大致可分为:
液体发酵管:无糖肉汤或蛋白胨水中,加入1%糖(醇)类指示剂,一支小玻管,经灭菌后备用。若被检细菌对营养要求较高时,则在试验前加入2%~5%无菌血清。
半固体发酵管:在液体糖(醇)发酵培养基中,加入0.3%~0.5%琼脂,溶化后分装试管,灭菌后让试管直立,使琼脂凝固,做成高层培养基,接种细菌应用接种针穿刺接种。
固体发酵管:此类培养基一般不常用,仅用于营养要求较高的某些细菌,在含糖类及5%~10%血清琼脂斜面上进行发酵试验。另外固体高层糖发酵管,可用于厌氧细菌糖发酵试验,如产气荚膜杆菌在含糖的固体高层发酵管中出现汹涌发酵(产生大量气体)。
双糖(或三糖)高层斜面发酵管:这种培养基含有葡萄糖和乳糖(或再加蔗糖),这两种糖(或三种糖)混在一起,制成高层斜面,其中葡萄糖和乳糖(或蔗糖)比例为1:10。
各种糖(醇)发酵管含糖(醇)的浓度,一般为0.5%~1%,有时可达2%。经121℃20~30min灭菌,容易水解变质,特别是在碱性溶液中更易破坏。
故糖(醇)发酵培养基常用高压蒸汽115℃15min灭菌。
应用的糖(醇)种类很多:
单糖:葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木胶糖、半乳糖;
双糖:乳糖、麦芽糖、蔗糖、覃糖;
多糖:菊糖、肝糖、糊精、淀粉;
醇:甘露醇、卫矛醇、山梨醇、侧金盏花醇、肌醇、丙三醇(甘油);
糖苷:水杨苷等。
最常用的指示剂有酚红、溴麝香草酚蓝、溴甲酚紫、酸性复红。
前两者颜色反应较敏感,但稳定性差,后二者比较稳定。特别是一些迟缓发酵的细菌,培养时间长,应用后二者指示剂。
酚红pH6.8(黄色)~pH8.4(红色)
2、甲基红试验(methyl red)
甲基红指示剂变色范围是pH4.4(红色)~pH6.2(黄色),产气肠杆菌分解葡萄糖产生丙酮酸,但又很快将丙酮酸脱羧,转化成醇等物质,则培养液的pH值仍在6.2以上,故此时加入甲基红指示剂,培养液呈黄色,此为阴性对照菌。阳性对照菌是大肠埃希氏菌,呈现红色为阳性。
3、V-P试验
伏-普试验,目的是检查细菌是否能分解葡萄糖,产生乙酰甲基甲醇。
阳性对照菌是产气肠杆菌,分解葡萄糖(被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中,36℃18~24h)产生丙酮酸,再将丙酮酸脱羧形成乙酰甲基甲醇,在碱性条件下(乙液-40%KOH溶液),被氧化为二乙酰,与培养基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基结合,通常在10min内形成红色化合物。
若不显色,放置于50℃水浴2h,或放置于37℃培养箱中4h,充分摇动,观察培养液反应结果,不显红色为阴性,阴性对照菌是大肠埃希氏菌。
4、ONPG试验
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷的缩写,利用该试剂可以检查被检细菌有无β-半乳糖苷酶和渗透酶,发酵乳糖的细菌具有这两种酶。
渗透酶将乳糖分子带入菌细胞内,而β-半乳糖苷酶可将乳糖的β-半乳糖苷链切断,产生葡萄糖和半乳糖。
迟缓发酵乳糖的细菌,缺乏渗透酶,而ONPG渗入菌细胞内,被β-半乳糖苷酶分解产生邻位硝基苯酚,一般在20~30min内显黄色,为阳性,对照菌为枸橼酸盐杆菌和亚利桑那菌。
方法:将被检细菌接种到1%的乳糖肉汤琼脂培养基上,37℃培养过夜。取菌苔接种于0.25ml生理盐水中做成悬液。加入1滴甲苯,并充分振摇,使酶释放。在悬液中再加入ONPG液0.25ml,混匀,置于37℃培养箱或水浴箱中,分别在20min和3h后观察培养液反应结果
不出现黄色者为阴性,对照菌是沙门氏菌。
5、氧化发酵试验
测定糖类的氧化或发酵及糖类未被利用的代谢类型。
氧化型:细菌在分解葡萄糖过程中,必须有氧分子参加。无氧环境中不能分解葡萄糖。
发酵型:在分解葡萄糖的过程中,可以进行无氧降解。发酵型细菌无论在有氧或无氧的环境中都能分解葡萄糖。
产碱型:不分解葡萄糖的细菌。
将待检菌同时穿刺接种两支HL培养基,其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡油,高度不少于1cm,37℃培养48h或更长,观察反应结果。
培养基变黄色为产酸。
两支培养基均产酸为发酵型细菌,仅不加石蜡的培养基产酸的是氧化型细菌,两支培养基均不变化的为产碱型细菌。
二、蛋白质、氨基酸及含氮化物代谢试验
1、苯丙氨酸脱氨酶试验
原理:某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶,可使苯丙氨酸脱氨形成苯丙酮酸,苯丙酮酸与三氯化铁发生螯合作用,形成绿色络合物。
方法:将被检细菌的斜面培养物(先增菌)大量移种到苯丙氨酸琼脂斜面上,37℃培养18-24h,再从斜面上滴加10%三氯化铁溶液4-5滴,使其自斜面培养物上缓缓流下,观察结果。
结果:溶液出现绿色为阳性,对照菌是变形杆菌;不变色为阴性,对照菌是产气肠杆菌。
2、脱羧酶试验
原理:某些细菌具有某种氨基酸的脱羧酶,可使氨基酸脱去羧基产生胺和二氧化碳,胺使pH值>7,此时指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为蓝色。
溴麝香草酚蓝酸性显黄色,碱性显紫色。
方法:将被检细菌接种到两支脱羧酶培养基中,其中一支不加氨基酸,另一支加赖氨酸/精氨酸/鸟氨酸,再在培养基上覆盖一层灭菌的液体石蜡,37℃培养18-24h,观察结果。
结果:两管培养基均含有葡萄糖,产酸,溴麝香草酚蓝由蓝变黄。含有氨基酸的一管出现脱羧基降解作用,产生碱性反应,溴麝香草酚蓝再由黄变蓝,为阳性。
鸟氨酸阴性对照菌为阴沟肠杆菌,显黄色。
3、靛基质(吲哚)试验
原理:某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲氨基苯甲醛结合,形成玫瑰红色化合物。
方法:将被检细菌接种到胰蛋白胨水培养基中,37℃培养24-48h后,滴加数滴试剂于培养基液面,轻轻摇动(不可剧烈振动),观察结果。
结果:出现红色为阳性,对照菌是大肠埃希氏菌;出现黄色为阴性,对照菌是产气肠杆菌。
4、硫化氢试验
原理:某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等),产生硫化氢,硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐反应,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
方法:将被检细菌以接种针穿刺接种于醋酸铅或双糖铁培养基(乳糖+葡萄糖)中,37℃培养24h,观察结果。
结果:有黑色出现为阳性。
说明:在硫化氢试验的培养基加入硫代硫酸钠的作用是还原作用,以保持培养基处于还原状态,是产生的硫化氢不被氧化。
产硫化氢较少的菌种可在试管口放置醋酸铅试条。
5、尿素酶试验
原理:某些细菌具有尿素酶,在含有尿素的培养基中,分解尿素产生氨,使培养基呈碱性,此时培养基中的酚红指示剂显红色。
方法:将被检细菌接种的尿素固体斜面培养基上,36℃培养4h检查一次,再每天检查一次,培养5天,观察结果。
结果:出现红色为阳性,对照菌为变形杆菌;变色为阴性,对照菌是大肠埃希氏菌。
三、枸橼酸盐利用试验
1、原理:
枸橼酸盐培养基系一综合性培养基,其中枸橼酸钠为碳的唯一来源,磷酸二氢铵是氮的唯一来源。
有的细菌能利用枸橼酸钠为碳源,能在培养基上生长,并且能分解枸橼酸盐,最后产生碳酸盐,使培养基变为碱性。
培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
不能利用枸橼酸盐为碳源的细菌在该培养基上不生长,培养基不变色。
2、方法:
将被检细菌的菌悬液(挑取菌苔后,洗至生理盐水中)接种到枸橼酸盐培养基上,37℃培养24h,观察结果。
3、结果:
培养基上有菌生长,培养基变为深蓝色为阳性,对照菌是产气肠杆菌;若培养基不变色,则继续培养7天,培养基仍不变色者为阴性,对照菌为大肠杆菌。
四、呼吸酶类试验
1、氧化酶试验
原理:某些细菌具有氧化酶,能将二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺试剂氧化(先使细胞色素C氧化,电子传递体)成红色醌类化合物。
方法:取白色洁净滤纸蘸取待测菌落,加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴;Ewing氏改进法,再加α-萘酚溶液1滴。
结果:阳性者立即出现粉红色,并逐渐加深,变为淡紫色,再到深紫色,Ewing氏改进法阳性于0.5min内呈现鲜蓝色,对照菌为绿脓杆菌(铜绿假单细胞菌);阴性者颜色无变化,Ewing氏法阴性为2min内不变色,对照菌为大肠杆菌。
1%盐酸二甲基对苯二胺溶液要避免接触含铁物质,防止出现假阳性反应。此试剂应少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,也可购置氧化酶试条。
该实验用于分辨革兰氏阴性杆菌中的肠杆菌科(阴性)与弧菌科(阳性)。
2、触酶活力试验
原理:具有触酶的细菌能催化过氧化酶,放出生态氧,继而形成氧分子,出现气泡。
方法:取3%过氧化氢0.5ml,滴加到不含血液的被检细菌琼脂培养物上,或滴加到不含血液的肉汤培养物中,观察结果。
结果:培养物出现气泡者为阳性。
说明:过氧化氢浓度过高(30%)会产生气泡出现假阳性;血液中含有触酶,容易出现假阳性。
3、硝酸盐还原试验
原理:某些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐,亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸,亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸,再与α-萘胺结合,生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(红色)。
方法:将被检细菌接种于硝酸盐培养基中,37℃培养1~4天,每天吸取培养物2ml,加甲液(对氨基苯磺酸0.8g,5mol/L醋酸100ml)和乙液(α-萘胺0.5g,5mol/L醋酸100ml)各数滴,同时以为接种细菌的培养基作对照,观察结果。
结果:出现红色为阳性。
说明:亚硝酸盐在自然界分布很广,容易污染试剂,硝酸盐不纯或保管不妥也可能含有亚硝酸盐,因此必须做空白对照;繁殖迅速而还原硝酸盐能力强的细菌如果培养时间过久,可能将亚硝酸盐全部分解为氨和氮,出现假阴性反应,故需每天试验,空白对照。
五、毒性酶类试验
1、溶血试验
原理:某些细菌在代谢过程中,产生溶血素,能使人或动物的红细胞发生溶解。
方法:
1)平板法:将被检细菌接种到血液琼脂平板培养基上,37℃培养24h。
2)试管法:取被检细菌16-18h肉汤培养物若干,加等量经生理盐水洗涤三次的2%羊红细胞悬液,置于37℃水浴箱中,30min后观察结果。
结果:
1)平板法:若菌落周围出现透明的溶血环,为完全溶血(β溶血),菌落周围出现绿色溶血环,为不完全溶血(α溶血),无溶血环为不溶血(γ溶血)。
2)试管法:液体澄清透明为溶血,阳性。
2、链激酶试验
原理:A群链球菌在代谢过程中,产生链激酶,能激活血液中的纤维蛋白酶原为溶纤维蛋白酶,促使纤维蛋白凝块溶解。
方法:取血浆0.2ml,放入灭菌小试管中,加无菌生理盐水0.8ml,再加被检细菌18-24h肉汤培养物0.5ml,充分混匀后,再加入0.25%氯化钙水溶液0.25ml,置于37℃水浴中,观察结果。
结果:10min内血浆先凝固,而后又开始溶解,溶解时间与链激酶含量成正比。链激酶含量多时,20min内凝固的血浆完全溶解。如无变化,应在水浴中持续2h、24h,分别观察结果。血浆凝块完全溶解者为阳性,时间越短表明毒性越强。24h血凝块仍不溶解者为阴性。
3、血浆凝固酶试验
原理:某些细菌能产生血浆凝固酶,分两种,一种结合在细菌细胞壁上,遇到血浆直接作用于血浆的纤维蛋白,使细菌凝成颗粒状,使用玻片法;另一种分泌到细菌细胞外,称为游离血浆凝固酶,能使血浆中的纤维蛋白原变为纤维蛋白,使用试管法试验。
方法:
1)玻片法:取生理盐水2滴,分别滴于载玻片上,以接种环挑取被检细菌菌落,放在2滴生理盐水中,研磨成浓菌悬液。在1滴悬液中加1滴未稀释的血浆,另一滴加入1滴生理盐水作为对照,迅速摇动,观察结果。
2)试管法:取3支小试管,每支加1:4稀释的新鲜血浆0.5ml,其中1支加被检细菌生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml,另一支加阳性菌株生理盐水悬液或肉汤培养物0.5ml作阳性对照,再一支加生理盐水或肉汤培养液0.5ml作阴性对照。3支试管置于37℃水浴箱中,每隔30min观察一次结果。
结果:
1)玻片法:若在加血浆的1滴中迅速出现凝固颗粒,在加生理盐水对照的1滴中未出现凝固颗粒,为阳性;若超过2min才开始出现凝固颗粒者不作阳性(多为非致病性)。
2)试管法:6h内,若试验管和阳性对照管出现凝固,阴性对照管不出现凝固,为阳性;多数阳性细菌在0.5-1h内发生凝固。
六、嗜盐试验
原理:在高于3%的氯化钠培养基上不生长或生长不好,但能在无言培养基上生长的,称为非嗜盐菌,如肠杆菌科。能在3%-6%氯化钠培养基上生长,但在无盐培养基上不生长,称为嗜盐菌,如副溶血性弧菌。在无盐和高盐培养基上均能生长,但长得不茂盛,称为耐盐菌,如葡萄球菌、铜绿假单细胞菌。
方法:取被检细菌分别接种到1支无盐葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化钠葡萄糖蛋白胨水中,37℃培养6-24h,观察生长情况。
结果:培养物出现浑浊生长为阳性。
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