单核增生李斯特菌的生化反应与检测方法!
单核增生李斯特菌,简称单增李斯特菌,革兰氏阳性小杆菌,大小为(0.4-0.5)μm×(0.5-2)μm,直或稍弯,多数菌体一端较大,似棒状,常呈V字型排列,有的呈丝状,偶尔可见双球状。在22℃-25℃环境可形成4根鞭毛。本菌对理化因素抵抗力较强。在士壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活:对碱和盐抵抗力强,对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺等均敏感。本菌营养要求不高,兼性厌氧。菌落初期极小,水滴样,经37℃数天培养后,直径可达2mm,初期菌落光滑、透明,后变灰暗。血平板上的菌落有β-型溶血环本菌耐碱不耐酸,在4℃-45℃均能生长,最适生长温度30℃-37℃。 它广泛存在于自然界中,食品中存在的单增李斯特氏菌对人类的安全具有危险,该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一,因此,在食品卫生微生物检验中,必须加以重视。
一、菌种简介
拉丁属名:Listeria monocytogenes
菌种名称:单核增生李斯特菌
其它编号:ATCC19115
培养基编号:75
培养温度:37.0℃
培养时间:18-24-小时
用途:质量控制菌种
注意事项:仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用。
二、菌种来源
李斯特氏菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的。为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特(1827-1912),1940年,在第三届国际微生物学大会上将其命名为李斯特氏菌。
三、菌种种类
国际上公认的李斯特菌共有以下七个菌株:
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、绵羊李斯特菌(Listeria iuanuii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)、威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西尔李斯特菌(Listeria seeligeri)、格雷李斯特菌(Listeria grayi)、默里李斯特菌(Listeria murrayi)。其中,单核细胞增生李斯特氏菌是唯一能够引起人类疾病的,它是一种人畜共患病的病原菌,中毒严重的可引起血液和脑组织感染。单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特氏菌,为革兰阳性菌,属厚壁菌门。
四、细菌分型
根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原,将单增李斯特氏菌分成13个血清型,分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。该菌与多种革兰阳性菌有共同抗原,故血清学诊断无意义。
本菌的抗原结构与毒力无关,且本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等多数革兰氏阳性菌和大肠杆菌有共同抗原,故血清学诊断无意义。
五、形态与染色
该菌为革兰氏阳性短杆菌,大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯,两端钝圆,常呈V字型排列,偶有球状、双球状,兼性厌氧、无芽胞,一般不形成荚膜,但在营养丰富的环境中可形成荚膜,在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性,该菌有4根周毛和1根端毛,但周毛易脱落。
幼龄培养物为革兰氏阳性,陈旧培养物可转为革兰氏阴性,呈两极着色,易误认为双球菌。
六、培养特性
该菌营养要求不高,在20-25℃培养有动力,穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长,肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2-42℃(也有报道在0℃能缓慢生长),最适培养温度为35--37℃,在pH中性至弱碱性(pH9.6)、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好,在pH3.8-4.4能缓慢生长,在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。在固体培养基上,菌落初始很小,透明,边缘整齐,呈露滴状,但随着菌落的增大,变得不透明。在5-7%的血平板上,菌落通常也不大,灰白色,刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上,用45角入射光照射菌落,通过解剖镜垂直观察,菌落呈兰色、灰色或兰灰色。
七、生化反应
该菌触酶阳性,氧化酶阴性,能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖(迟发酵)、山梨醇、海藻糖、果糖,不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖,不利用枸橼酸盐,40%胆汁不溶解,吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性,VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。
八、抵抗力
该菌对理化因素抵抗力较强,在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活,对碱和盐抵抗力强,60-70℃经5-20min可杀死,70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。
九、分布范围
单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中,不易被冻融,能耐受较高的渗透压,该菌在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有存在,所以动物很容易食入该菌。
十、检测方法
1、细菌培养法
该菌营养要求不高,兼性厌氧,最适在含有CO2的微需氧环境中生长,生长温度范围—1.5℃-45℃,最适温度为30℃-37℃,能在普通冰箱冷藏室生长,是一种典型的耐冷性细菌,同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。
食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌,以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAM P)等免疫学检测,被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括:冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30d ,有时甚至长达一年。常温增菌需培养24h 至7d 。故传统检测方法需要7-11d 才能分离鉴定出李斯特氏菌,故传统方法检测周期较长。
2、血清凝集法
根据菌体抗原和鞭毛抗原,LM分为16个血清型:1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原结构与毒力无关,对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b,占全球本病病例约90%。
3、分子生物学检测方法
随着核酸探针杂交技术的应用,使对单核细胞增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平。
①探针检测技术
这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子生物
学技术。早在1988年,Atin 等就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一个500bp DNA 片断并测序,以此序列合成4种寡核苷酸探针,以32P 标记该探针,经斑点杂交实验证实,该探针只与李斯特氏菌反应,与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴性,表现出很好的特异性。但探针杂交无法分辨死菌和活菌,尽管通过增菌可使死菌比例减少,相对地减少假阳性,但并不能完全杜绝假阳性结果。随着探针技术的逐渐成熟,人们开始关注将多个DNA 特异性探针固定到芯片上,制成基因芯片。基因芯片的特点是可同时检测多种菌,可以减少实验次数,并且检测所需的引物较少。
②聚合酶链式反应(poly merase chain reaction ,PCR)检测技术
PCR 的发展已经相当成熟,广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR 扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计,一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hly A 、iap 、inl 、Dth-18等毒力基因。利用PCR 方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好,不足之处是灵敏度较低;将样品培养物经化学抽提后再进行扩增,提高了样品的检出率;并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR 技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。例如Nogva 等运用5′-核酸酶PCR 对单增李斯特氏菌定量;Choia 等运用cPCR 对李斯特氏菌进行定量;Long 等以hly 为靶基因,采用PCRELISA联合检测技术。
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