大鼠心肌细胞的培养操作与应用!
一、背景
H9C2(2-1)细胞该细胞由KimesB和BrandtB从BD1X大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆得到;表现出许多骨骼肌的特性。这个细胞株中的成肌细胞能融合形成多核的肌管,并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%,融合发生得很快。
二、H9C2(2-1)细胞培养操作
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;
1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
用于肢体缺血预适应大鼠血清对HUVEC和H9c2(2-1)细胞H2O2损伤的保护作用及机制研究:
观察LIPC大鼠的血清是否可以减轻H2O2所导致的人脐静脉内皮细胞HUVEC和鼠胚胎心肌细胞H9c2(2-1)的氧化应激损伤,分析Nrf2所调控的抗氧化基因是否参与了该过程,以及有可能所涉及的信号通路。
材料和方法:
(1)成年健康SD大鼠,用改良的大鼠尾动脉血压测定仪套管套在大鼠右后肢,加压至200mmHg阻断股动脉造成右后肢短暂缺血,持续5分钟,放气减压恢复血流,持续10分钟,共3个循环。预适应结束后立即腹主动脉无菌采血获得大鼠早期肢体预适应血清。预适应后间隔24小时采血,获得大鼠延迟肢体预适应血清,分装冻存于-80℃。
(2)建立HUVEC和H9c2(2-1)细胞的H2O2损伤模型,参考IC50作为后续实验造模浓度。HUVEC和H9c2(2-1)细胞分为5组,对照组(control,C),模型组(model,M),大鼠早期预适应血清组(preconditioning serum,PS),大鼠延迟预适应血清组(delayed preconditioning serum,DPS),正常大鼠血清组(normal rat serum,NRS),预先用2.5%,5%(V/V)各种血清孵育6小时和12小时,然后用H2O2处理2小时,用MTT法检测各种血清预处理对HUVEC和H9c2(2-1)细胞活性的影响。
(3)应用AnnexinV-FITC和PI双染进一步检测细胞的凋亡情况。
(4)细胞处理完成后,用8μM的DHE孵育45分钟,荧光显微镜下检测ROS的含量。
(5)应用LDH,MDA,CK检测试剂盒检测细胞培养上清液中LDH,CK的活性及MDA的浓度。
(6)采用SOD,CAT,GSH-Px检测试剂盒检测细胞培养上清液中SOD,CAT,GSH-Px的活性。
(7)采用免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测各组细胞Nrf2的核转位情况。
(8)采用real-time RT-PCR检测各组细胞中抗氧化基因CAT,HO-1,SOD1,SOD2,GSH-Px1mRNA的水平。
(9)采用Western Blot法检测各组细胞中CAT,HO-1,SOD1,SOD2的蛋白表达情况。
(10)用25μM PI3K的抑制剂LY294002和26μM MEK1/2抑制剂U0126提前1小时处理细胞,观察这两种抑制剂对PS和DPS作用的影响。
(11)各实验组数据采用mean±SD表示,利用SPSS13.0统计软件分析,组间差异比较采用单因素方差分析。P<0.05认为有显著差异。
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