质粒中量提取试剂盒的操作方法与注意事项!
一、概述
本试剂盒采用碱裂解法裂解细菌,再通过离心吸附柱在高盐和低pH条件下高效结合溶液中的DNA。离心吸附柱中采用的特制玻纤膜材料可高效、与一吸附DNA。本试剂盒适用于提取5-30 ml过夜培养的大肠杆菌,质粒提取得率和质量与不宿主菌的种类和培养条件、细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素等因素有关。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。
二、试剂盒组成
三、储存条件
试剂盒可置于室温(15-25℃)干燥条件下,可保存12个月,更长时间的保存可置于4℃。注意:第一次使用前将RNase A加入Solution I中混匀后建议置于4℃保存;Solution III 建议置于4℃保存。
四、注意事项
1、Solution I 在使用前应先加入RNase A(将试剂盒中提供的RNase A全部加入),混匀后4℃保存。
2、Solution II 如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,即可恢复澄清。使用后应立即盖紧盖子,以避免空气中的CO2不Solution II 中的NaOH反应,从而造成溶液裂解效率下降。
3、DNA Wash Buffer 在使用前先加入无水乙醇(按试剂盒包装规定的体积加入)。
4、所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心。
5、去蛋白液PE可以有效去除残留的蛋白污染,当宿主菌为endA+(TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列)等核酸酶含量较高的菌株时,则推荐使用去蛋白液PE。
五、操作方法
1、取5-30 ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,4,000 rpm 离心3 min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
2、向有菌体沉淀的离心管中加入2 ml Solution I(已加入RNase A),使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀,然后静置5 min。
注意:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入2 ml Solution II,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
注意:温和地混合,不要剧烈震荡,以免打断基因组DNA,造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠,所用时间丌应超过5min,以免质粒受到破坏。如果未变得清亮,可能由于菌体过多,裂解丌彻底,应减少菌体量。
4、向离心管中加入2.8 ml Solution III,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10 min。
注意:Solution III 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。
5、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 (吸附柱放入收集管中),注意尽量丌要吸出沉淀。12,000 rpm离心30 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。
6、可选步骤:向吸附柱中加入3.5 ml去蛋白液 Solution PE,12,000 rpm离心30 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌(TG1,BL21,HB101,JM系列,ET12567等),这些宿主菌含有大量的核酸酶,易降解质粒DNA,推荐采用此步。如果宿主菌是endA-宿主菌(DH5α,TOP10等),这步可省略。
7、向吸附柱中加入3.5 ml DNA Wash Buffer(使用前请先检查是否已加入相应体积的无水乙醇),12,000 rpm离心30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。
8、重复操作步骤7。
9、将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm离心1 min,将吸附柱中残余的漂洗液去除。
10、将吸附柱开盖,置于室温放置3-5 min,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的15ml离心管中,向吸附膜的中间部位滴加0.5-1.0 ml洗脱缓冲液Elution Buffer(或者ddH2O),室温放置2 min,12,000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中。
注意:将洗脱缓冲液Elution Buffer(或者ddH2O)预热至60℃将有助于提高质粒洗脱的效果。
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