黄曲霉的检验检疫方法与注意事项！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2021/12/22 13:21

黄曲霉的检验检疫方法与注意事项！

黄曲霉，半知菌类，一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮食、粮制品及其它霉腐的有机物上。菌落生长较快，结构疏松，表面灰绿色，背面无色或略呈褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗（一般为双层），小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子合成孢子头，可用于产生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是酿造工业中的常见菌种。

一、菌种简介

平台编号：bio-52621

规格：冻干物

拉丁属名：Aspergillus flavus Link

菌株名称：黄曲霉

其他编号：AS3.3928

培养基编号：15

培养温度：25-28℃

培养时间：5-7 天

用途：科研

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用

二、培养基

综合马铃薯培养基（PDA）

20%马铃薯汁 1L 葡萄糖 20g MgSO4.7H2O 1.5g KH2PO4 3g

Vitanib B1 (硫胺素) Trace 微量约 8mg Agar (琼脂) 20g pH 自然

20%马铃薯汁配制方法：马铃薯洗净去皮，取 200 克切成小块 , 加水 1000 毫升煮沸 20 分钟后滤去马铃薯块，将滤液补足 1000ml。

三、保藏条件

斜面菌种和冻干菌种应在 2-8°C 保存。西林瓶菌种请置于-20°C 保存。

四、检验检疫方法

1、薄层层析

薄层层析（thin-layer chromatography,tlc)是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年，它被列为aoac (association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。

2、液相色谱

液相色谱（liquid chromatography,lc)与薄层层析在许多方面具有相似性，二者互相补充.通常用tlc进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后，再用lc进行黄曲霉毒素的定量测定。

3、免疫化学分析

利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法，也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法（radioimmunoassay,ria),酶联免疫法（enzyme-linked of immunosorbent assay,elisa)和免疫层析法（immunoaflinity column assay,ica).它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定。

(1) 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-hplc法

免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果，但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素（如黄曲霉毒素b1)含量，而且易出现假阳性结果，难以控制.免疫亲和柱法（包括荧光光度法和hplc法）却能达到既定量准确又快速简便的要求。

(2) 酶联免疫吸附法

1996年，nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便，敏感，特异，可作为多种抗原或抗体的测定，20世纪70年代后期，该方法引入真菌毒素的检测中，下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素b1。

原理：将已知抗原吸附在固态载体表面，洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分，然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合，再加入酶底物.在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。

(3) 微柱筛选法

可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素b1,b2,g1,g2的总量。

原理：样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后，在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光，则样品为阴性（方法灵敏度为5-10ug/kg).由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素b1,b2,g1,g2,所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。

(4) 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法

一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法.由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5—10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品，这种方法能估算黄曲霉毒素的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。

五、注意事项

1）冻干首次活化，干粉要全部用完，不能预留，用无菌吸管吸取 0.3ml 的培养液（即以上建议的培养基配方，不加琼脂）或者无菌水，滴入冻干管中，轻轻振荡至其溶解。吸取全部菌悬液，接种在培养基上（建议不超过 2 支斜面或平板；或直接接种液体培养基）；经过冷冻干燥保藏，菌种处于休眠状态，复苏培养时可能会延迟生长，这时需较长的培养时间；若您收到的是已复苏的培养物（非冻干菌），则可以直接用于您的实验，或根据需要转接培养；如有不明白之处，请务必先咨询我单位技术人员，避免不必要的损失；

2）微生物菌种应保藏于低温、清洁干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；

3）菌种操作应在无菌条件下进行；转种完毕，应经灭菌再做丢弃处理；

4）应根据菌种状况及时转接，冻干菌种保藏时间通常为 2-25 年；

5）菌种使用过程中如出现杂菌污染或菌种生产性能下降，应及时和微生物菌种查询网联系。

6）如若有菌种复苏不活或者污染等情况，请在收到菌钟后 2 个月内联系，逾期不予受理；

7）打管操作需由专业微生物技术人员在相应的防护设备中进行，生物危害程度为三类的菌种应在生物安全柜中操作，打管时冻干管应远离面部，保护眼睛。

8）西林瓶开封：用 75%酒精棉擦拭西林瓶外部，在安全柜内使用尖嘴钳去除塑料盖及铝盖，注意不要同时打开胶塞。缓慢开启胶塞，用 75%酒精棉消毒瓶口部分，使用无菌吸管注入 0.5ml 适宜的液体培养基复溶冻干粉末。

9）安瓿瓶开封：用浸过 75％酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰加热其顶端，滴少量（2-3 滴）无菌水至加热顶端使之破裂，用锉刀或者镊子敲下已破裂的安瓿管顶端并将冻干管开口处在火焰上过一遍，并保持在火焰旁操作。

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