菌种培养基的背景与应用!
一、背景
菌种培养基用于四环素检定中蜡样芽孢杆菌的培养(SN标准),成分(g/L):胰蛋白胨:10.0;牛肉浸粉:5.0;氯化钠:2.5;琼脂:14.0;pH值6.4-6.6。
检验原理:胰蛋白胨提供碳源和氮源;牛肉膏提供维生素和氨基酸;琼脂是培养基的凝固剂;氯化钠能维持均衡的渗透压。
用法:称取本品31.5克,加热溶解于1000ml蒸馏水中,121℃高压灭菌15分钟备用。
蜡样芽孢杆菌(学名:Bacillus cereus),又称仙人掌杆菌,是一种革兰氏阳性菌,β溶血性的杆状细菌。
蜡样芽孢杆菌是兼性厌氧性。与其他芽孢杆菌相同,它会产生防御性的内芽孢。它的致病因子包括施普善(cereolysin)和磷脂酶C(Phospholipase C)。
菌体细胞杆状,末端方,成短或长链,1.0~1.2×3.0~5.0微米。产芽孢,芽孢圆形或柱形,中生或近中生,1.0~1.5微米,孢囊无明显膨大。
革兰氏阳性,无荚膜,运动。菌落大,表面粗糙,扁平,不规则。菌落形态:在普通琼脂平板培养基上,37℃,培养24 h,可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7 mm。
在M.Y.P培养基上生长更旺盛,菌落直径达8-10 mm,质地更软,挑起来呈丝状,培养时间稍长,菌落表面呈毛玻璃状,并产生红色色素。
在蛋白胨酵母膏平板上菌落为灰白色,不透明,表面较粗糙,似毛玻璃状或融蜡状,菌落较大。
蜡状芽胞杆菌细菌对外界有害因子抵抗力强,分布广,是典型的菌体细胞,有部分菌株能产生肠毒素,呈杆状(约1.5μm),有色,孢子呈椭圆形,有致呕吐型和腹泻型胃肠炎肠毒素两类。
二、应用
用于产细菌素蜡样芽孢杆菌的筛选、鉴定及培养基优化研究:
以金黄色葡萄球菌为指示菌,从土壤中分离筛选得到目的菌株,命名为XH25。在排除有机酸与过氧化氢实验以及蛋白酶K敏感试验后综合推测出菌株XH25的抑菌效果可能来源于细菌素。
筛选得到的XH25菌株的各项生理生化测定结果显示:革兰氏染色试验、过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、硝酸还原试验、酯酶试验、M.R试验、V.P试验、卵磷脂酶水解试验、酪素水解试验和糖醇类发酵试验都呈阳性,H2S试验呈阴性;再结合菌株XH25的16S rRNA分子鉴定通过序列比对分析、系统发育树的构建,鉴定出菌株XH25为蜡样芽孢杆菌。
采用Plackett-Burman(简称PB)试验设计和响应面分析法(Response surface methodology,简称RSM)对菌株XH25的发酵培养基进行优化。先用Plackett-Burman试验设计筛选出对细菌素产生有显著影响的因素,确定影响细菌素产生的主要成分;然后通过最陡爬坡试验找出RSM设计的中心点;最后利用RSM分析法对培养基进行优化。
优化结果表明,培养基的最优组合为:可溶性淀粉15.32g/L、硫酸铵6.02g/L、大豆蛋白胨12.5g/L、硫酸镁0.25g/L、培养基pH6.15、温度30℃时,抑菌圈直径比优化前提高了21.7%。通过模型验证试验得出实际值12.90mm与模型预测值12.76mm有很好的拟合性,说明实验准确性高。
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