人皮肤黑色素瘤细胞的培养方法与应用!
一、背景
SK-MEL-1人皮肤黑色素瘤细胞是由Oettgen·F及其同事从一名29岁的患有广泛、快速进展性恶性黑色素瘤的白人男性患者的胸导管中分离建立的。SK-MEL-1细胞可产生黑色素,电镜检测发现SK-MEL-1细胞中色素颗粒与自身合成和吞噬作用相关。在63%的恶性黑色素瘤患者和10%其他疾病患者体内发现了针对SK-MEL-1细胞的抗体。
二、培养步骤
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
传代方法:
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3、轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
三、应用
用于microRNA-33a通过靶向HIF-1α抑制黑色素瘤侵袭转移的分子机制研究:
通过real-time PCR法检测miR-33a/b在低转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM35及高转移侵袭力的皮肤黑色素瘤细胞株WM451、A375和SK-MEL-1中的表达量。明确miR-33a/b在黑色素瘤细胞系中的表达情况,筛选miR-33a/b高表达和低表达的黑色素瘤细胞系作为进一步的实验研究对象。
构建pYr-LVX-pri-miR-33a慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后感染A375细胞,建立hsa-miR-33a稳定过表达细胞系A375-pYr-LVX-pir-miR-33a;构建pYr-LVX-miR-33a-sponge慢病毒载体,并将其包装成慢病毒,然后分别感染WM35、WM451细胞,建立hsa-miR-33a表达抑制的稳定细胞系WM35-pYr-LVX-miR-33a-sponge和、VM451-pYr-LVX-miR-33a-sponge o以1niR-33a表达稳定上调/抑制细胞系为研究对象,运用MTT法检测细胞增殖能力。
平板克隆形成实验检测细胞克隆数;流式细胞术检测细胞凋亡率;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭力;、Vestern Blot法检测与EMT相关的E-钙粘连蛋白(E-Cadherin)、N-钙粘连蛋白(N-Cadherin)的表达情况。多层面探讨miR-33a的表达对细胞增殖、细胞凋亡、侵袭转移和EMT等表型的影响。
通过皮下接种及尾静脉注射A375及A375-pYr-LVX-pir-miR-33a细胞建立裸鼠种植瘤及移植瘤模型,观察裸鼠皮下种植瘤的大小、体积、质量及肺脏转移灶数目的变化情况。
采用生物信息学分析法预测HIF-1α可能为miR-33a的下游靶因;Western Blot法检测miR-33a表达变化时HIF-1α蛋白的表达水平;应用双荧光素酶基因报告法进一步验证HIF-1α是否为miR-33a的直接靶基因。
研究结果:miR-33a与1niR-33b在低转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株WM35中表达量均高,而在高转移侵袭力的人皮肤黑色素瘤细胞株VM451、A375和SK-MEL-1中的表达量相对较低(WM35>WM451>A375>SK-MEL-1);上调A375细胞株中1niR-33a的表达能抑制细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化;抑制WM451和WM35细胞株中miR-33a的表达能促进细胞增殖、侵袭转移和上皮-间质转化;miR-33a对细胞凋亡的影响无统计学差异。
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