小鼠子宫平滑肌细胞的分离和原代培养！

               小鼠子宫平滑肌细胞的分离和原代培养！

一、背景及概述

平滑肌细胞又叫平滑肌纤维，系构成平滑肌的纤维状长细胞。由于平滑肌所分布的部位不同，平滑肌细胞的长度很不一致，在小血管壁上的平滑肌细胞长度仅有20μm左右，妊娠期子宫壁平滑肌细胞可长达500μm，位于一般器官平滑肌细胞的长度约200μm左右，此细胞的宽度在7μm以内。小鼠子宫平滑肌细胞分离自子宫组织；小鼠子宫平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。

小鼠子宫平滑肌细胞的主要功能：①子宫平滑肌能保持子宫的基本形态，在孕期能最大化的扩张子宫容积，保证胎儿孕育环境；②平滑肌细胞有收缩舒张能力，在生产时能形成生理性的缩腹环，推动胎儿向下移动，辅助生产。

二、细胞详述

子宫是产生月经和孕育胎儿的器官，位于骨盆腔中央，在膀胱与直肠之间。

卵巢分泌的性激素能刺激子宫平滑肌纤维，而引起与性周期相应的肥大和增生。另外，妊娠时子宫肌层的平滑肌纤维，可肥大到哺乳类平滑肌的最大值。分娩时子宫肌能对脑垂体后叶激素的催产素发生反应而收缩。

子宫肌层较厚，非孕时20px，由大量平滑肌束和少量弹力纤维组成，分为内层（肌纤维环形排列）、中层（肌纤维交叉排列）、外层（肌纤维纵行排列）3层。子宫收缩时压迫血管能有效控制子宫出血。

三、细胞特性

1)细胞来源于手术切除的正常子宫组织。

2)细胞鉴定：平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养。

四、细胞分离和原代培养

将小鼠麻醉处死，迅速取出子宫放于预冷Ｈａｎｋｅ’ｓ液中，冲洗2-3次，以剪刀将周围组织去除干净，将子宫外膜用刀片轻轻刮掉，将子宫纵向剖平铺，内膜面朝上，用镊子固定住一端，从固定处开始用一次性1毫升注射器的针头（打弯成30°角）作为分离器轻轻将子宫内膜和基质部分刮掉，将内膜和基质去除干净的子宫平滑肌条剪碎，用3毫升0.25％的胶原酶和0.25％胰酶混合消化液37℃水浴震荡消化1h，2ml有血清培养液终止消化，吹打数次，200目细胞筛过滤吸取悬液，再通过400目细胞筛，收集滤液1000rpm／10min离心，基础培养液洗２次，去除细胞碎片，接种于35mm培养皿中培养。台盼兰排斥试验查细胞存活率大于90％。用２０％ＦＣＳＤＭＥＭ－Ｆ１２培养液，放入37℃、95５％湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养，每隔3天换一次液。体外培养３－４天后形成子宫平滑肌细胞单层，约２周后细胞融合成片。倒置相差显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞质丰富，胞质密度高，不透明，平行排列成束，部分重叠，表现为典型的“谷”、“峰”状生长。

五、相关研究

有研究探讨神经调节素B受体(neuromedinBreceptor，NMBR)在妊娠小鼠子宫平滑肌细胞中mRNA、蛋白时空表达的变化及其与分娩启动的关系和机制。方法：按妊娠阶段的不同，将小鼠分为未孕组、早孕组、中孕组、晚孕组、产时组和产后组，每组12例。应用半定量RT-PCR和Western免疫印迹技术分别检测子宫平滑肌中NMBR，IL-6和HSP70mRNA及蛋白表达；利用NoShift转录因子分析法检测NF-κB-P65的DNA结合活性，并分析各指标与分娩的关系及其相关性。结果：产时组NMBRmRNA的相对表达量显著高于未孕、早孕、晚孕、产后组(P<0.05)，但与中孕组相比差异无统计学意义(P>0.05)；产时组NMBR蛋白表达量显著高于其它各组(P<0.01)。NF-κB-P65DNA结合活性产时组显著高于未孕、晚孕和产后组(P<0.05)。IL-6mRNA表达产时组显著高于未孕、晚孕和产后组(P<0.05)，其蛋白表达产时组亦显著高于未孕和产后组。HSP70mRNA表达量产时组显著高于未孕和产后组(P<0.05)，HSP70蛋白的表达量产时组明显高于晚孕、未孕组(P<0.05)。临产前后子宫平滑肌细胞P65DNA结合活性、IL-6mRNA的表达均与NMBRmRNA的变化呈正相关(r=0.40，P<0.01；r=0.30，P<0.05)；P65，HSP70mRNA的变化亦与NMBR的变化呈正相关(r=0.40，P<0.01；r=0.49，P<0.01)；但HSP70与P65无相关性。结论：子宫平滑肌细胞中NMBRmRNA和蛋白表达在临产时达最高峰。NMBR可借助NF-κBP65-IL-6通路、通过调节HSP70表达参与分娩发动和维持，但其对HSP70表达的影响不依赖P65途径。

此外，还有实验探讨银杏叶提取物(GinkgobilobaExtract，EGb761)对神经调节素B受体(NeuromedinBreceptor，NMBR)激动剂诱导的分娩期小鼠子宫平滑肌细胞内核因子kappaB(NuclearfactorkappaB，NF-κB)活性及白介素6(Interleukin-6，IL-6)表达水平的影响。方法：原代培养小鼠子宫平滑肌细胞，用免疫组化鉴定细胞及检测细胞内NMBR表达。结合siRNA、磷酸化ELISA、RealtimePCR及ELISA等实验技术检测细胞内NF-κB活性和IL-6表达。结果：1.EGb761有效实验浓度筛选：(1)EGb761对平滑肌细胞内NF-κB活性的影响：高浓度组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；低浓度组、中浓度组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)EGb761对NMBR激动剂诱导的平滑肌细胞内NF-κB活性的影响：高浓度组显著低于低浓度组、NMB组及对照组(P<0.05)；中浓度与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；低浓度组与NMB组差异无统计学意义(P>0.05)，因此选择高浓度作为以下实验作用浓度。2.siRNA干预前后EGb761对分娩子宫平滑肌细胞中NF-κB活性及IL-6表达水平的影响：(1)NMBRsiRNA干预前后平滑肌细胞内NF-κB活性、IL-6表达水平的影响：干预前EGb761+NMB组与对照组、NMB组比较差异有统计学意义(p<0.05)，与EGb761组比较差异无统计学意义(p>0.05)；十预后NMBRsiRNA+EGb761+NMB组与EGb761+NMB组及三对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，与NMBRsiRNA+NMB组比较差异无统计学意义(p>0.05)。(2)NF-KBsiRNA干预前后对平滑肌细胞中IL-6表达水平的影响：其变化规律与NMBRsiRNA干预前后对IL-6的影响一致。3.NMBRsiRNA干预前后NF-κB活性与IL-6表达的相关性分析：干预前及干预后两者变化均呈明显的正相关(干预前r=0.894，P<0.01；干预后r=0.892，P<0.01)。4.分级阻断NMBR和NF-κB对IL-6表达影响的比较：两种干预对IL-6表达水平的影响差异无统计学意义(基因水平p>0.20，蛋白水平P>0.05)。结论：EGb761可抑制NMBR激动剂诱导的分娩期小鼠子宫平滑肌细胞内NF-κB活性及IL-6表达的上调作用，其作用机制可能与其影响NMBR分子间的作用有关。

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