MKN7人胃癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2023/10/19 15:28

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MKN7人胃癌贴壁细胞系的培养操作及应用！

一、背景

MKN7人胃癌贴壁细胞系来源于一位39岁女性胃癌上皮细胞样细胞，KN7人胃癌贴壁细胞系培养基: RPMI1640培养基，90%；FBS，10%。

KN7人胃癌贴壁细胞系生长条件:气相：空气，95%；二氧化碳，5%;温度：37℃。

二、MKN7人胃癌贴壁细胞系培养操作

1）复苏MKN7人胃癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）MKN7人胃癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）MKN7人胃癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1.MKN7人胃癌贴壁细胞系细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

MKN7人胃癌贴壁细胞系可以用于PNO1通过自噬效应促进胃癌增殖的机制研究：

自噬作为一种程序性死亡机制在肿瘤中的作用越来越受到研究者们的关注,靶向自噬已经成为肿瘤治疗的一种重要手段。之前的研究表明核糖体装配因子PNO1可以调节肿瘤的增殖、侵袭、自噬和凋亡等表型,但目前在胃癌中的作用还没有被报道。本研究旨在揭示PNO1在胃癌中的作用及调节机制,为胃癌治疗提供新的靶标。

方法：利用生物数据库中的信息检测PNO1在胃癌和癌旁组织中的表达,并收集青岛大学附属医院经病理确诊的胃癌和癌旁手术标本进行免疫组化分析验证,使用小干扰RNA、慢病毒颗粒构建PNO1敲低和过表达的胃癌细胞株,使用蛋白免疫印迹和实时定量PCR来验证PNO1在胃癌细胞的表达及转染效率,通过平板克隆形成实验和Ed U细胞增殖实验检测PNO1对胃癌细胞增殖的影响,使用蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检测PNO1对自噬的调节,通过蛋白免疫印迹分析PNO1对PI3K/AKT/mtor信号通路的调控作用,最后通过小鼠胃原位荷瘤模型验证PNO1在体内对胃癌增殖的作用。

结果：在本研究中,发现PNO1在胃癌组织和细胞中高表达并且相对高表达的PNO1水平与胃癌患者的不良预后相关,过表达PNO1提高了胃癌细胞的增殖水平,敲低PNO1抑制了体内外胃癌的增殖能力,并提高了胃癌细胞的自噬水平,抑制自噬逆转了PNO1敲低导致胃癌细胞增殖能力下降的趋势,此外,敲低PNO1还抑制了PI3K/AKT/mtor信号通路的激活。

结论：研究表明PNO1高表达是胃癌患者的不良预后因素,PNO1通过抑制自噬效应促进了胃癌的增殖能力,这为探索胃癌发病机制提供了新的思路,靶向PNO1/自噬轴成为胃癌治疗的潜在方案。

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