小鼠淋巴细胞白血病的培养条件与步骤及其应用!
一、背景
小鼠淋巴细胞白血病是由G.Moore等(1966)和P.Himmelfarb等(1967)报导。此细胞系广泛用于化学因子和天然产物细胞毒活性的常规筛选。接种裸鼠在21天内100%(5/5)成瘤。
二、小鼠淋巴细胞白血病细胞培养条件
1、大小鼠淋巴细胞白血病细胞培养基:RPMI-1640培养基(不含Hepes)+10%胎牛血清+1%双抗+800ng/ml Taxol
2、温度:37.0°C
3、气体:空气95%,CO2 5%
三、小鼠淋巴细胞白血病细胞培养步骤
(一)小鼠淋巴细胞白血病细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
(二)小鼠淋巴细胞白血病细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于小鼠淋巴细胞白血病细胞,传代可参考以下方法:
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗小鼠淋巴细胞白血病细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3、轻轻吹打小鼠淋巴细胞白血病细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液,将JeKo-1细胞悬液按1:2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
(四)小鼠淋巴细胞白血病细胞冻存:
1、小鼠淋巴细胞白血病细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时,弃25cm2培养瓶中的培养液,用PBS清洗细胞一次;
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中,倒置显微镜下观察,待小鼠淋巴细胞白血病细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化,轻轻吹打细胞使之脱落,然后将悬液转移至15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3、用适量的冻存液重悬小鼠淋巴细胞白血病细胞,并放置于冻存管中;
4、先将小鼠淋巴细胞白血病细胞冻存管放置于-20℃1.5h,然后将其移入-80℃。
四、应用
小鼠淋巴细胞白血病可以用于AS2O3对L1210细胞增殖、凋亡及自噬的影响:
将As2O3应用于治疗M3型急性早幼粒细胞白血病(APL),之后又发展到治疗维甲酸治疗缓解后复发的M3型患者,完全缓解率达93%以上,已被公认为M3型白血病治疗首选药物。一般认为As2O3治疗APL的主要机制是诱导白血病细胞凋亡,很少考虑其对细胞自噬的影响。
本研究从As2O3对L1210细胞增殖、凋亡及自噬的影响,探讨其抗白血病的更可能的隐藏机制。本研究采用MTT法及Brdu-Elisa法测定不同浓度As2O3对L1210细胞增殖的影响,流式细胞术及AO/EB双染法检测细胞凋亡,AO染色及MDC染色检测细胞自噬,免疫印迹法检测增殖相关蛋白PCNA、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、自噬相关蛋白LC3B的表达。
另用苯诱导的小鼠再生障碍性贫血模型检测As2O3是否能刺激骨髓细胞的造血功能。
细胞实验结果显示:As2O3对L1210白血病细胞呈剂量、时间依赖性生长抑制作用,24h、48h、72h半数抑制浓度(IC50)分别为11.61μmol/L±0.05、3.34μmol/L±0.03、0.13μmol/L±0.08。As2O3作用24h,细胞凋亡率随着As2O3浓度的升高而升高,5、10、20μmol/L的凋亡率分别为26.52%±0.02、30.99%±0.06、74.48%±0.05。AO/EB双染法可观察到细胞形态发生明显变化,如细胞核浓缩、凋亡细胞表面膜出泡、体积变小、细胞破裂并出现凋亡小体等形态学特征,并呈剂量依赖性。AO染色及MDC染色可观察到自噬阳性显色,且药物浓度越高,阳性率越高。
Western-blot结果显示:As2O3能上调自噬相关蛋白LC3B、促凋亡蛋白BAX的表达水平,使细胞增殖相关蛋白PCNA、抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,并程剂量依赖性。体内实验表明,As2O3能使再障小鼠外周血细胞数量、骨髓细胞数量、网织红细胞绝对值、血红蛋白含量增高,改善肝、肾组织的损伤情况。
综上所述,As2O3通过诱导L1210细胞凋亡及自噬的产生来达到治疗淋巴细胞白血病,能刺激再障小鼠骨髓细胞的造血功能。
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