犬疱疹病毒PCR试剂盒的背景与应用及实验操作！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/01/18 16:33

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犬疱疹病毒PCR试剂盒的背景与应用及实验操作！

一、背景

犬疱疹病毒PCR试剂盒是一种用于快速检测和定量犬疱疹病毒的分子生物学检测试剂盒。

该试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）技术，通过一对引物介导，可以在动植物体外对特定基因（DNA）片段进行快速酶促扩增。经过n个热循环扩增后，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n倍，使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。

犬疱疹病毒PCR试剂盒具有特异性强、灵敏度高、快速高效等优点。该试剂盒的特异性取决于引物与模板DNA的特异正确结合以及碱基配对原则等。

此外，该试剂盒是针对犬疱疹病毒设计的，因此在其他动物或环境中检测到的结果可能不准确。

二、犬疱疹病毒PCR试剂盒实验操作

1、模板制备（样本制备区）

建议使用配套水生动物病害基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。

2、添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）

请于-20℃条件下保存，有效期12个月

取出所需测试数的已含有反应液A-TSV-I的PCR管，将试剂完全解冻，离心30秒，在管盖上标记管名（阴性对照管NG、样品XX、阳性对照管PG）。打开管盖向各管管底分别加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管分别沿管壁加入2μL模板，顺序为待测样品模板、PG-TSV-I，依次盖好各管管盖，离心30秒，立即进行扩增反应。

3、扩增反应（扩增及产物分析区）

①恒温仪器63℃条件下反应60 min。待仪器升温至63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤2中离心后的PCR反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。

②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15 s，63℃45 s作为一个循环，于63℃45 s处收集荧光信号，60个循环。

其他仪器请参照仪器说明书进行设置。

三、应用

犬疱疹病毒PCR试剂盒可以用于犬疱疹病毒的分离鉴定及US6基因的生物信息学分析：

犬疱疹病毒(Canine herpesvirus,CHV)感染仅存在于犬中,是新生幼犬的急性、非发热型致死性疾病。由US6基因编码的gD糖蛋白是疱疹病毒囊膜上的重要组成部分,它具有识别各自红细胞的能力,使各个疱疹病毒都有自己的特征。因此,本研究根据自然发病犬的临床症状、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、病毒的分离和纯化、动物回归实验和基因生物信息学分析的实验手段证实了该疾病为CHV感染所致,另外,对US6基因编码的gD糖蛋白的主要抗原区域进行分析并构建了表达载体。

试验结果如下：

1、从病犬肝脏中提取的DNA经PCR扩增,检测出大小为357 bp的目的条带,经NCBI的Blast比对验证该病毒为CHV,毒株命名为CHV-JX株,并测得该病毒的TCID50为10-4.39/0.1mL;该病毒感染的犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)在电镜下可看到圆形的病毒粒子,细胞出现了空泡化;在显微镜下,可以看到24h内细胞开始出现圆缩、变暗,逐渐向周围扩散,最后细胞脱落。将CHV-JX毒株接种到15日龄的幼犬,腹部皮肤可见疱疹,解剖见肾脏出现坏死灶等典型性的疱疹病毒临床症状和病理变化。

2、与对照组相比,除24h组外,48h和96h组细胞的凋亡率显著升高(P<0.05);与对照组相比,细胞线粒体膜电位在第24h、48h和96h时均极显著升高(P<0.01);与对照组相比,细胞的ROS在24h时先升高,48h,72h,96h时下降;与对照组相比,除24h组外,其他组细胞的pH均下降。

3、经PCR扩增得到条带(大小为1200 bp左右)的US6全基因与国内外CHV毒株的US6基因进行同源性分析,与澳大利亚、英国和美国犬CHV的核苷酸同源性结果高达99.9%,同时氨基酸同源性为100%,然而它与非犬源CHV毒株的同源率很低。DNA序列分析得出该基因编码346个氨基酸,使用全基因合成的方法合成该基因片段,并克隆到表达载体pET32a(+)上,成功构建了重组质粒CHV-3F-3R。获得的犬源疱疹病毒CHV-JX感染犬后,生殖器官周围可见典型的疱疹病毒临床症状;CHV-JX感染MDCK后可导致细胞的凋亡;同时成功构建了该病毒US6基因的主要抗原区域的重组质粒。

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