脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒的使用方法及应用!
一、背景
脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒采用SYBR Green染料法实时荧光PCR技术,针对脑膜炎败血金黄杆菌的基因高度保守区域设计特异性引物,用荧光PCR技术对脑膜炎败血金黄杆菌的核酸进行体外扩增检测,在反应体系中含脑膜炎败血金黄杆菌核酸模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号,利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性、定量分析。
二、脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒使用方法
1、样品处理(样本处理区)
1.1样本前处理
按照试剂盒操作说明或者临床样品处理方法做好样品前处理。
1.2 DNA提取
根据您实验室的具体情况和样品类型,选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠,我们建议使用商品化的试剂盒进行提取,严格按照对应试剂盒说明书进行操作,样本核酸提取过程中应避免污染,提取好的模板样品如不能立即检测,建议-15℃以下保存。推荐采用我们公司研发生产的试剂盒:细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)
2、试剂配制(试剂准备区)
2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温(20~25℃),注意避免强光照射,待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s,使用低吸附吸头分液取样,避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数,设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照;样品每满7份,多配制1份)。
2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂,充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s,按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。
2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识(请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位,切勿标记在八联PCR反应管盖中间)。将PCR反应管转移至样本准备区,剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3、加样(样本处理区)
将步骤1提取的DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μL,加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心,核酸加样过程中应避免污染。
4、PCR扩增(核酸扩增区)
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内。
4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为25μL。
荧光通道选择:检测通道荧光染料法(SYBR Green I),淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI系列仪器请勿选择ROX参比荧光,选择None即可。
4.3按照脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒说明书设置循环参数
5、脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒结果分析判定
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节),以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
5.2结果判断
阳性:检测通道Ct值≤35.0,且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑:检测通道Ct值>35.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性,否则为阴性。
阴性:检测结果Ct值无Ct值,无明显的扩增曲线。
三、应用
脑膜炎败血金黄杆菌PCR试剂盒可以用于金黄杆菌临床分离株耐药性分析及β-内酰胺酶基因型研究:
1、了解临床分离金黄杆菌对常用抗菌药物的耐药特性;
2、了解金黄杆菌β-内酰胺酶产生情况;
3、研究金黄杆菌β-内酰胺酶基因型及分布情况。
材料与方法:菌株来源共收集金黄杆菌52株,其中主要为产吲哚黄杆菌和脑膜脓毒性金杆菌,分别为25株和23株。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603、阴沟肠杆菌029M、接合试验受体菌E.coli C600和铜绿假单胞菌pa119均为本科保存菌株。
方法:琼脂稀释法测定18种药物对52株金黄杆菌的最低抑菌浓度,三纸片增效法、改良三维试验法进行金黄杆菌产β-内酰胺酶表型筛查,PCR方法和全编码基因分析β-内酰胺酶基因型,接合转移试验和质粒DNA的检测了解β-内酰胺酶基因是否具有可转移性,等电聚焦电泳测定β-内酰胺酶的pI值。
结果:52株金黄杆菌对碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南的耐药率为73.1%,氨曲南为90.4%,阿米卡星和β-内酰胺抗生素的耐药率均大于40%。喹诺酮类药物加替沙星、左氧氟沙星耐药率为11.5%、9.6%,以及利福平8.7%,均表现出很强的抗菌活性。
金黄杆菌β-内酰胺酶检测结果,25株产吲哚黄杆菌的表型和PCR方法分别检测出MBLs 19株和20株,基因型以bla IND-1和bla IND-2为主,分别为9株和10株,菌株C-15携带bla IND-1,MBLs表型检测及β-内酰胺酶初筛均为阴性。
14株脑膜脓毒性金杆菌表型和PCR方法分别检测出MBLs 17株,基因型为blaB1,2株;blaB2,5株;blaB3,4株;blaB11,4株;blaGOB-1,1株;blaGOB-10,1株。仅7株细菌检出产ESBLs,均为脑膜脓毒性金杆菌,基因型为3株blaCME-1和4株blaCME-2,其中5株细菌同时检出MBLs。52株细菌均未检出产AmpC酶。携带β-内酰胺酶基因的金黄杆菌接合试验均未成功。质粒DNA均未检出β-内酰胺酶基因。
结论:
1、金黄杆菌多重耐药现象严重,对碳青霉烯类等多种抗菌药物呈高度耐药;
2、脑膜脓毒性金杆菌具有较高的ESBLs和MBLs携带率,基因型分别以blaCME和blaB为主,可同时携带两种MBLs基因,且blaCME常和MBLs基因同时携带;
3、产吲哚黄杆菌具有很高的MBLs检出率,本地区携带的MBLs基因型以bla IND-1和bla IND-2为主。
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