拟杆菌属通用PCR试剂盒的背景与应用及使用方法!
一、背景
拟杆菌属通用PCR试剂盒是一种生物试剂盒,用于检测拟杆菌属的特异性基因。这种试剂盒可以用来确认拟杆菌属的存在和种类。
二、拟杆菌属通用PCR试剂盒使用方法
稀释拟杆菌属通用PCR试剂盒阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
1、注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
3、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头,下同)。
4、在7号管中加入5μL 1×10E8拷贝/μL的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5、换枪头,在6号管中加入5μL 1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6、换枪头,在5号管中加入5μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7、重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
8、如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
9、用自选方法纯化样品的DNA。
10、如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
11、在标记管中按拟杆菌属通用PCR试剂盒说明书加入各成分。
12、盖上盖子后上机,按拟杆菌属通用PCR试剂盒说明书参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
13、具体操作按所用仪器推荐的流程进行。拟杆菌属通用PCR试剂盒中所含的荧光染料在不结合DNA时,最大吸收光谱在471 nm,结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm,最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
14、如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
15、如果把拟杆菌属通用PCR试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。
三、应用
拟杆菌属通用PCR试剂盒可以用于实时定量PCR检测血中肠道菌DNA及快速药敏试验的方法学研究:
建立利用实时定量PCR(RQ-PCR)检测血标本中肠道菌DNA的方法并对临床标本进行初步检测,并建立RQ-PCR快速检测肠道菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素敏感性的方法,以期能初步了解外科发热患者中肠道菌菌血症的现状,并建立快速药敏方法以便有利于指导治疗。
选择脆弱拟杆菌谷氨酰胺合成酶基因作为靶基因设计引物和TaqMan探针,使用拟杆菌属通用PCR试剂盒建立20μl的RQ-PCR反应体系,采用含靶基因特异性扩增片段的重组质粒建立标准曲线,并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因组DNA,建立实时定量PCR检测血标本中脆弱拟菌DNA的方法学,并对32份外科发热患者的标本进行了临床验证。结果显示引物和探针特异性好,检测灵敏度为10°拷贝/μl(103CFU/ml),标准曲线相关系数在0.985~0.999之间。
不同浓度的脆弱拟杆菌样本检测的平均准确性为(107.30±2.11)%;批内及批间重复性平均变异系数(CV)分别为(18.44±1.16)%和(19.00±4.47)%。血标本中脆弱拟杆菌DNA平均提取效率为(60.13±5.66)%,提取效率平均变异系数为(15.62±2.47)%。含有同等量脆弱拟杆菌的临床血标本存放在-20℃或-70℃6个月内,脆弱拟杆菌DNA拷贝数差异无显著性(P=0.467~0.840),该方法可用于临床标本的脆弱拟杆菌DNA检测,并具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点。
采用此方法学对32例外科发热患者的84份血标本进行了实时定量PCR检测。结果显示10个标本检测到脆弱拟杆菌,阳性率约为11.90%,含量约1.78~9.24×103CFU/ml,所有患者的血培养结果均为脆弱拟杆菌阴性。
在含有相同浓度大肠杆菌的LB液体培养基和血中,分组加入不同的抗生素,并设立生长对照,分别培养1、2、3、4小时后提取标本的基因组DNA,以本研究组先前建立的实时定量PCR检测大肠埃希菌DNA的方法,对标本进行检测,观察不同抗生素组和生长对照组的生长曲线,来判定药敏结果,并与纸片法进行比较。
结果显示实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素的药物敏感性,结果与常规纸片法一致,但更快速。
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