MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系的知识与应用!
一、背景
MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系是由A.Yunis等人于1975年从一名65岁的高加索男性获得的胰腺肿瘤组织中建立的。据报道,该细胞系倍增时间约40小时,在软琼脂中的集落形成效率约19%。该细胞系对天冬酰胺酶敏感。
二、MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系培养步骤
(一)MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞复苏:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中),培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
(二)MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
a)对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3、轻轻吹打细胞,完全脱落后吸出,在1000RPM条件下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4、按5-6ml/瓶补加培养液,将细胞悬液按1:2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
(三)MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系细胞冻存:
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时,弃25cm2培养瓶中的培养液,用PBS清洗细胞一次;
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中,倒置显微镜下观察,待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化,轻轻吹打细胞使之脱落,然后将悬液转移至15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3、用适量的冻存液重悬细胞,并放置于冻存管中;
4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h,然后将其移入-80℃
三、应用
MIA PaCa-2人胰腺导管癌贴壁细胞系可以用于Linc00152对胰腺癌细胞MIA PaCa-2增殖侵袭及迁移的影响:
探讨长链非编码RNA Linc00152对人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2增殖、侵袭和迁移能力的影响。
方法:于医院胆胰科采集到20对胰腺癌组织和其对应的癌旁正常的胰腺组织;人正常胰腺细胞HPDE及各组胰腺癌细胞系MIA PaCa-2细胞、BxPC-3细胞、Capan2细胞购于美国ATCC细胞库。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)验证组织及各组细胞中Linc00152的表达水平。
人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2细胞随机分为阴性对照组(si-NC组)和Linc00152下调组(si-Linc00152组)。设计Linc00152的siRNA(small interfering RNA)干扰模型,si-NC组和si-Linc00152组分别转染阴性对照序列(Negative control)、siRNA抑制序列,采用RT-qPCR验证两组MIA PaCa-2细胞中Linc00152的转染效率并进行后续实验。
采用CCK-8法和集落形成实验检测两组MIA PaCa-2细胞的增殖能力;流式细胞术检测两组MIA PaCa-2细胞的细胞周期;Western-blot检测两组胰腺癌细胞MIA PaCa-2的细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK4的表达:
采用Transwell实验和细胞划痕实验测两组MIA PaCa-2细胞的侵袭、迁移能力;Western-blot检测两组MIA PaCa-2的细胞相关蛋白vimentin及N-cadherin的表达水平。结果:与癌旁正常的胰腺组织相比,Linc00152在胰腺癌组织中表达明显增加(P<0.001),Linc00152在胰腺癌细胞系中的表达均高于人正常胰腺细胞HPDE,且在MIA PaCa-2中表达最高(P<0.01)。
成功设计siRNA干扰模型,将阴性对照序列、siRNA抑制序列转染48 h后,RT-qPCR结果显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中的Linc00152表达明显降低(P<0.01)。分别于6 h、24 h、48 h、72 h、96 h加CCK-8溶液测两组MIA PaCa-2的细胞活力,结果与si-NC组相比,si-Linc00152组中的细胞在48 h、72 h、96 h增殖显著下降(P<0.01)。
集落形成实验8天后,si-NC组的集落形成数目是(412±12),而si-Linc00152组的集落形成是(226±8),结果显示沉默Linc00152后细胞克隆数目明显减少(P<0.01)。流式细胞术结果显示沉默Linc00152后,与si-NC组相比,si-Linc00152组MIA PaCa-2在细胞周期中的G0/G1期百分比上升,提示发生了细胞周期阻滞(P<0.01)。
Transwell侵袭实验显示,沉默Linc00152后细胞侵袭的数目明显减少(P<0.01)。Transwell迁移实验中显示,沉默Linc00152后细胞迁移的数目明显减少(P<0.01)。细胞划痕实验结果均显示,与对照组si-NC组对比,si-Linc00152组中细胞迁移,侵袭能力也显著降低(P<0.01)。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台,并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站,自设设备及技术的微生物菌种保藏中心!欢迎广大客户来询!
H-EMC-SS人软骨肉瘤细胞的处理方法与培养步骤!
ATCC 25557死亡梭杆菌的特点与优势及微生物培养方法!
人保寿险细胞免疫疗法医疗保险首例赔付圆满成功!
高职学生盲赠造血干细胞:为别人带去希望,值得!
相关产品
沙门氏菌生化鉴定试剂盒(GB)
安洁清4号实验室玻璃器皿专用洗涤剂
Parabacteroides merdae
Paraburkholderia aromaticivorans
Paraburkholderia caledonica
Paraburkholderia eburnea
Paraburkholderia flava
Paraburkholderia fungorum
Paraburkholderia ginsengiterrae
Paraburkholderia graminis
Paraburkholderia monticola
Paraburkholderia panaciterrae
Xanthobacter agilis
Thermochromatium tepidum
Planctopirus limnophila
关注
拨打电话
留言咨询