嗜冷黄杆菌PCR试剂盒的知识与应用及相关研究!
一、背景
嗜冷黄杆菌PCR试剂盒是一种常用的分子生物学工具,它可以帮助科研人员快速、准确地检测和鉴定嗜冷黄杆菌。
通过使用针对嗜冷黄杆菌的PCR试剂盒,研究人员可以特异性地扩增嗜冷黄杆菌的DNA片段,从而实现对该物种的准确检测。这种检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可以检测出痕量嗜冷黄杆菌的存在,同时避免其他微生物的干扰。
二、嗜冷黄杆菌PCR试剂盒操作步骤
(一)稀释标准曲线样品(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。
1、标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
2、用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。
3、在7号管中加入5μL阳性对照(浓度为1×10E8拷贝/μL,试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4、换枪头,在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5、换枪头,在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
(二)样品DNA的制备
7、用自选方法纯化样品的DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8、如果有N个样品,则需要进行N+2个样品提取,多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。
(三)设置qPCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
9、如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第一步稀释得到的标准曲线系列稀释液的第4号做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复):
(四)数据处理
11、如果把嗜冷黄杆菌PCR试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
12、如果把嗜冷黄杆菌PCR试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性
三、应用
嗜冷黄杆菌PCR试剂盒可以用于虹鳟源嗜冷黄杆菌的生物学特性及其致病性研究:
实验从患病虹鳟溃烂肌肉处分离到2株细菌,命名为CH06和CH07株,并对分离菌株的理化特性、分类地位、致病性和耐药性开展了深入研究,以期为该病的防控提供参考。
结果表明,CH06和CH07株在胰蛋白酵母提取物(tryptone yeast extract salts,TYES)琼脂平板上呈煎蛋状外观,产黄色素,氧化酶和过氧化氢酶阳性,能水解明胶和酪蛋白,不能水解淀粉,不能利用果糖、半乳糖和七叶苷等。16S r RNA比对结果显示,CH06和CH07株与嗜冷黄杆菌模式株NBRC 15942的同源性分别为99.35%和99.42%。
本研究还探索了嗜冷黄杆菌肌肉注射感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)后病原菌在鱼组织内的动态分布情况,以期为BCWD的防控提供理论支撑。以1.0×108CFU/m L浓度的嗜冷黄杆菌CH06株菌液肌肉注射感染实验虹鳟,感染后12 h、24h、96 h观察虹鳟临床症状及组织病变,并利用嗜冷黄杆菌PCR试剂盒检测各组织病原载量。
患病鱼的临床病征表现为体色发黑,游动缓慢或不动,食欲不振,尾柄部注射处肌肉溃烂,鳃苍白,脾脏肿大,伴有腹水。组织病理观察显示,嗜冷黄杆菌感染后实验鱼注射处肌纤维断裂、溶解;脾窦扩张,其内充满红细胞;肾脏组织含铁血黄素增加,出现大量空泡变性,肾小管上皮细胞变性、坏死,肾间质炎性细胞浸润。嗜冷黄杆菌PCR试剂盒检测结果表明,肌肉注射感染12 h后即可在脾脏、肝脏、肾脏、肠道、鳃、脑和尾鳍中检出嗜冷黄杆菌,鳃病原载量最高为(1.62±0.28)×103copy/μL。
感染后24 h,脾脏、脑中病原载量较12 h时上升最多,其他组织病原载量与感染12 h时水平一致,脾脏病原载量为(1.26±0.37)×104copy/μL,显著高于其他组织(P<0.05)。感染96 h后脾脏中的病原载量显著高于其他组织(P<0.05),达到(1.15±0.58)×107copy/μL;肝脏、肾脏、脾脏中的病原载量较24 h时上升最多。所有被检组织中病原菌载量随时间延长均呈上升趋势。另外,三个时间点脾脏的病原平均载量最高,其次为肾脏,然后是鳃。嗜冷黄杆菌人工感染虹鳟后,脾脏是细菌的重要增殖场所。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台,并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站,自设设备及技术的微生物菌种保藏中心!欢迎广大客户来询!
H-EMC-SS人软骨肉瘤细胞的处理方法与培养步骤!
ATCC 25557死亡梭杆菌的特点与优势及微生物培养方法!
人保寿险细胞免疫疗法医疗保险首例赔付圆满成功!
高职学生盲赠造血干细胞:为别人带去希望,值得!
相关产品
沙门氏菌生化鉴定试剂盒(GB)
安洁清4号实验室玻璃器皿专用洗涤剂
Parabacteroides merdae
Paraburkholderia aromaticivorans
Paraburkholderia caledonica
Paraburkholderia eburnea
Paraburkholderia flava
Paraburkholderia fungorum
Paraburkholderia ginsengiterrae
Paraburkholderia graminis
Paraburkholderia monticola
Paraburkholderia panaciterrae
Xanthobacter agilis
Thermochromatium tepidum
Planctopirus limnophila
关注
拨打电话
留言咨询