绒猴EBV转化的白细胞的应用及培养操作规程！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/02/19 16:47

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绒猴EBV转化的白细胞的应用及培养操作规程！

一、背景

绒猴EBV转化的白细胞源自暴露于人白血球中抽提的EB病毒的绒猴白血球；B95-8细胞是一个连续株，并能释放高滴度的转染EB病毒。此细胞提供EB病毒用于建立人的连续淋巴细胞株。

二、绒猴EBV转化的白细胞培养操作规程

1、培养基及培养冻存条件准备:

1)准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO),90%;优质胎牛血清,10%。

2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37℃,培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配,液氮储存。

2、绒猴EBV转化的白细胞处理:

1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻,移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

对于悬浮细胞,传代可参考以下方法:

方法一:收集细胞,1000RPM,常温条件下离心5分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二:可选择半数换液方式,弃去半数培养基后,将剩余细胞悬起,将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)绒猴EBV转化的白细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时,应将细胞收集,1000RPM,常温条件下离心5分钟,少量保存上清液(防止细胞吸走),加入部分新鲜培养基,吹打均匀后,加入到冻存管中,在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。

三、应用

绒猴EBV转化的白细胞可以用于锁核酸核酶抑制EBV-LMP1基因表达及其对B95-8细胞生物学影响初步研究：

B95-8细胞系是一种由暴露于人白血球中抽提的EB病毒的绒猴白细胞转化而来的连续株细胞系。该细胞系可以用于产生EB病毒，以用于建立人的连续淋巴细胞株。

针对鼻咽癌EBV-LMP1的高效10～23型DZ167为基础，经LNA修饰设计合成LANzyme，以EBV-LMP1阳性的B95-8细胞为实验对象，比较DZ167和LNA167对LMP1表达的抑制作用，并观察其对B95-8细胞生物学的影响。

根据前期筛选的脱氧核酶DZ167为基础，设计合成锁核酸核酶LAN167，比较DZ167、LAN167对B95-8细胞靶基因EBV-LMP1的抑制效应。

方法：以B95-8为原型，EBV-LMP1基因为抑制靶点，设计合成脱氧核酶DZ167，对其5’端及3’端前2个结合臂分别进行硫代化修饰或引入2个LNA单体，并设计无催化活性中心的无序DNAzyme对照序列，所有序列5’端用FITC标记。经脂质体转染B95-8细胞，分为硫代修饰DZ167组（S-DZ167）、锁核酸核酶LNA167组、无序DZ167组。同时设立未转染空白对照组。转染后24h，荧光显微镜观察活细胞中荧光的分布情况，流式细胞仪测转染率。转染12h、24h、48h、72h及96h，采用Real-Time PCR评价S-DZ167、LNA167对LMP1稳定性及抑制时效关系。转染后48h采用Western blot方法检测LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白表达的抑制情况。

结果：转染后24h，荧光显微镜观察各组均有绿色荧光表达，核酶主要分布于细胞浆、细胞膜。无序DZ167组、S-DZ167组、LNA167组转染效率分别为75.5%、76.7%及77.6%。

对LMP1稳定性及抑制时效关系评价结果示：与未转染组相比，LNA167组及S-DZ167组于转染后12h、24h、48h、72h对96h，LMP1均保持一定的抑制效应，抑制率分别为，23.73%，33.93%，44.89%，27.45%，12.24%；45.76%，51.79%，71.43%，54.90%，22.45%。转染12h，LNA167及S-DZ167就表现出对LMP1的抑制作用，以48h最明显，之后逐渐下降；转染72h后，LNA167组与S-DZ167组抑制率相比，差异有显著性（P＜0.05）；转染至96h，仍然表现出对LMP1mRNA一定抑制效应，与未转染组相比，LNA167组差异有显著性（P＜0.05），而S-DZ167组差异无显著性（P＞0.05），两组相比虽然差异无显著性（P＞0.05），但LNA167组对LMP1mRNA抑制程度仍高于S-DZ167组。

未转染组与无序DZ167相比差异均无显著性（P＞0.05）。Western blot检测结果显示：与未转染组比较，无序DZ167组对EBV-LMP1蛋白表达抑制率为5.89%，差异无显著性（P＞0.05）；LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白抑制率分别为49%、75.02%，LNA167与S-DZ167能不同程度地抑制EBV-LMP1蛋白，但LNA167抑制效应明显高于S-DZ167，差异有显著性（P＜0.05）。

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