耐久肠球菌PCR试剂盒的知识与工作原理及应用！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/02/20 17:11

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耐久肠球菌PCR试剂盒的知识与工作原理及应用！

一、背景

耐久肠球菌PCR试剂盒是一种用于检测耐久肠球菌的分子生物学试剂盒。耐久肠球菌PCR试剂盒使用染料法或探针法荧光定量PCR技术进行检测，具有更高的灵敏度和特异性。

耐久肠球菌PCR试剂盒可进行50次PCR检测，适用于无内毒素试管中的细菌内毒素检查。它具有以下特点：即开即用，只需提供DNA模板；引物经过精心优化，专一性强，只扩增耐久肠球菌，与其他微生物没有交叉反应；提供阳性对照等。

二、耐久肠球菌PCR试剂盒原理

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物考核、病原体检测等诸多领域。定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外,还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等。

三、应用

耐久肠球菌PCR试剂盒可以用于饲草青贮微生物菌群动态变化与乳酸菌的鉴定筛选：

以玉米、苜蓿和直穗鹅观草为材料,开展单独青贮和混合青贮发酵过程中微生物菌群特性的研究,主要结论如下:

(1)乳酸菌、好氧细菌、大肠杆菌、酵母及霉菌存在于青贮原料、青贮发酵过程中和发酵完成后等所有时期,不同时期的数量有较大差异;青贮原料上附生的乳酸菌数量远少于有害微生物的数量;除玉米外,各原料表面附生乳酸菌数量均未达到105 cfu/g FM,且玉米上附生的乳酸菌数量远多于苜蓿和直穗鹅观草;同一茬次苜蓿不同品种间附生的乳酸菌数量无明显差异;不同茬次甘农3号苜蓿上附生的乳酸菌数量基本没有变化,但第二茬上的有害微生物显著增多;随着原料含水量的下降,苜蓿表面的乳酸菌逐渐增多,有害微生物的数量逐渐减少。

(2)发酵开始后,各种微生物较青贮原料上的起始菌落数均有较大增长;发酵过程中各种微生物的数量基本都存在缓慢变化、迅速增长、达到值后下降、最后稳定在较低水平的变化过程,受原料特性、发酵条件、添加剂等的影响,有的原料微生物数量在青贮过程中出现两次甚至三次升降变化;不同微生物开始迅速增殖、达到值的时间可能相同也可能不同,不同微生物数量的值也不相同;混贮原料特性、配比等也影响发酵过程中各类微生物的数量、值及达到值的时间;有的青贮在发酵完成后出现各种微生物数量激增的现象;发酵过程中,乳酸菌数量的值为109.50～1010.38 cfu/g FM,值出现在发酵15天或20天。

(3)发酵过程中,第二茬甘农3号苜蓿青贮中各类微生物的数量总体上多于茬,且达到峰值的时间较早,峰值较小;总体而言,苜蓿青贮中各类微生物的数量较高,直穗鹅观草次之,玉米较少;随着含水量的降低,苜蓿青贮中各类微生物的数量逐渐减少;添加糖蜜可以促进乳酸菌的繁殖;乳酸菌的数量在自然青贮发酵过程中不具优势,其数量与好氧细菌、酵母与霉菌等的数量相当;大肠杆菌的数量远少于其他各类微生物的数量。

(4)从青贮原料、青贮发酵初期和后期分离出54株乳酸菌,这些菌株分属于5个属的10个菌种,包括戊糖片球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、希氏肠球菌、蒙氏肠球菌、融合魏斯氏菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种、耐久肠球菌（使用耐久肠球菌PCR试剂盒鉴定）和弯曲乳杆菌,其中戊糖片球菌、植物乳杆菌和屎肠球菌较多。

(5)筛选出GI7、GI11、GI24、GI44、GI62等5株产酸速率较快的菌株,其中植物乳杆菌GI62产酸速率和生长速度较快,最适合用作青贮乳酸菌添加剂菌种;使用乳酸菌添加剂能够增加苜蓿青贮中乳酸菌的数量,降低pH值,处理组植物乳杆菌GI62+戊糖片球菌GI11+乳酸片球菌GI7效果。

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