大鼠胚胎心肌细胞的应用及培养操作步骤!
一、背景
大鼠胚胎心肌细胞是一株由Kimes·B和Brandt·B从BD1X大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆得到的细胞株;H9c2(2-1)细胞表现出许多骨骼肌的特性。H9c2(2-1)细胞中的成肌细胞能融合形成多核的肌管,并对乙酰胆碱的刺激发生反应。如果培养基中的血清浓度下降到1%,H9c2(2-1)细胞融合发生得很快。
二、细胞培养操作步骤
1、大鼠胚胎心肌细胞培养基及培养冻存条件准备
1)准备DMEM培养基;优质胎牛血清,10%;双抗,1%。
2)大鼠胚胎心肌细胞培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)大鼠胚胎心肌细胞冻存液:90%血清,10%DMSO,现用现配。
2、大鼠胚胎心肌细胞处理:
1)冻存细胞的复苏:
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2)大鼠胚胎心肌细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法:
1、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3、轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3)大鼠胚胎心肌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面T25瓶为例;
1、细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中,可使用血球计数板计数,来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2、1000rpm离心3-5min,去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞,按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。
3、将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80度冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
三、应用
大鼠胚胎心肌细胞可以用于miRNA-193a-3p对大鼠胚胎心肌细胞H9C2增殖和凋亡功能的影响:
胚胎心脏发育和先心病的发生受多种遗传因素共同调节,TBX1(T-box factor1)基因、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路都已被证实是其中较为重要的环节。
前期研究发现,TBX1基因表达下调对TGF-β2及其通路的靶向调控可能是通过下调miR-193a-3p的表达实现的,但这条通路如何实现细胞水平的调控、对细胞功能有何影响目前仍不明确。鉴于许多miRNA对相关生物学活动的调控都依赖于对细胞的增殖或凋亡的调节,本研究将从miR-193a-3p对大鼠胚胎心肌细胞H9C2增殖和凋亡的影响入手,推断其参与心脏发育和先天性心脏病发病的可能作用机制。
方法:
(1)将miR-193a-3p mimics,miR-193a-3p inhibitor分别转染至大鼠胚胎心肌细胞H9C2,qRT-PCR检测转染效率。
(2)以CCK-8法分别检测miR-193a-3p过表达和表达减低后细胞增殖能力的变化。
(3)流式细胞术(Annexin V-FITC/PI双染法)检测转染48h后心肌细胞的凋亡水平。
(4)实验数据使用SPSS19.0软件分析(计量数据以均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义)。
结果:
(1)与NC组相比,miR-193a-3p过表达后H9C2细胞的增殖受到抑制(P<0.01),而miR-193a-3p表达减低后心肌细胞的增殖活性增加(P<0.05)。
(2)与NC组相比,转染miR-193a-3p mimics 48h后H9C2细胞的凋亡率增高(P<0.05),而转染miR-193a-3p inhibitor 48h后心肌细胞的凋亡率减低(P<0.05),上述二者的改变均以早期凋亡为主。
结论:miR-193a-3p能够负向调节大鼠胚胎心肌细胞H9C2的增殖,正向调控其凋亡,其中对凋亡的调控环节可能位于凋亡早期;miR-193a-3p可能通过抑制心肌细胞的增殖、促进其凋亡参与心脏发育和先天性心脏病的发生。
北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台,并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站,自设设备及技术的微生物菌种保藏中心!欢迎广大客户来询!
H-EMC-SS人软骨肉瘤细胞的处理方法与培养步骤!
ATCC 25557死亡梭杆菌的特点与优势及微生物培养方法!
人保寿险细胞免疫疗法医疗保险首例赔付圆满成功!
高职学生盲赠造血干细胞:为别人带去希望,值得!
相关产品
沙门氏菌生化鉴定试剂盒(GB)
安洁清4号实验室玻璃器皿专用洗涤剂
Parabacteroides merdae
Paraburkholderia aromaticivorans
Paraburkholderia caledonica
Paraburkholderia eburnea
Paraburkholderia flava
Paraburkholderia fungorum
Paraburkholderia ginsengiterrae
Paraburkholderia graminis
Paraburkholderia monticola
Paraburkholderia panaciterrae
Xanthobacter agilis
Thermochromatium tepidum
Planctopirus limnophila
关注
拨打电话
留言咨询