人胃腺癌细胞(低分化)的应用及培养操作步骤！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/03/07 17:03

人胃腺癌细胞(低分化)的应用及培养操作步骤！

一、背景

人胃腺癌细胞(低分化)源自一位62岁的胃癌（未分化腺癌）患者，表达CEA。STR检测发现该细胞被HeLa细胞污染。

胃低分化腺癌是胃癌当中的一种，胃癌根据细胞核分裂程度，可以分为高分化、中分化、低分化。低分化代表胃癌细胞分化程度比较差，分化潜能比较大。低分化的癌肿瘤恶性程度高，生长快，容易发生转移。进行治疗时，或在进行肿瘤危险因素评估时，低分化的肿瘤出现复发转移的风险相对高，高分化癌细胞已经具有可塑性已经成型，恶性程度相对比较低。如果检测是低分化胃癌，其危险分期较高。

二、人胃腺癌细胞(低分化)培养操作

1)复苏人胃腺癌细胞(低分化)：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL人胃腺癌细胞(低分化)悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将人胃腺癌细胞(低分化)悬液加入6 cm平皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第三天换液并检查细胞密度。

2)人人胃腺癌细胞(低分化)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人多发性骨髓瘤细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-3min（视细胞消化情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将人胃腺癌细胞(低分化)悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人胃腺癌细胞(低分化)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

人胃腺癌细胞(低分化)可以用于二烯丙基二硫抑制人胃低分化腺癌增殖的转录组学研究：

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)可以抑制多种肿瘤细胞增殖,但具体作用机制尚未完全阐明。本研究旨在构建DADS处理胃癌MGC803细胞差异表达基因表达谱、差异转录因子活性谱、差异microRNA,研究DADS抑制人胃癌MGC803细胞增殖的分子机制。

方法：通过人全基因组寡核苷酸微阵列芯片、转录因子活性谱芯片、microRNA芯片检测DADS作用于MGC803细胞后差异基因的表达谱;Real-time PCR验证MMP9、TIMP3,Real-time PCR验证miR-222、miR-665。

结果：

1、系统构建了DADS处理胃癌MGC803细胞差异基因表达谱,表达相差1.5倍以上为差异具有显著性。与对照组相比,处理组上调基因1293个(>2.0基因384个),下调基因1228个(>2.0基因202个)。利用dchip软件以t test,P<0.001水平筛选数据。结果显示,处理组MGC803细胞和未处理组明确表达2521个基因,其中,292个在处理组中明确表达,而未处理组表达下调,116个在未处理组明确表达,而处理组表达下调。Hierarchical Clustering分析显示,处理组和未处理组在全基因表达谱上存在明显差异。差异表达基因能够区分处理组和未处理组。通过Real-time PCR证实了MMP9和TIMP3基因在处理前后的表达情况,提示这两个基因可能是DADS抑制胃癌侵袭转移的分子标记。

2、差异表达基因的功能分类,通过多种生物信息学软件对基因芯片数据基因综合分析,系统评价了差异表达基因的功能分类。Panther软件分析发现上调基因共参与152条pathway,61条pathway的实际参与基因数量超过预期基因值,而“Angiogenesis”、“Integrin signalling pathway”和“Oxidative stress response”3条pathway的P<0.05。下调基因共参与41条pathway,其中41条pathway超过了预期基因数,但P>0.05。上调基因共参与229个BP分类,106个BP分类中实际参与基因数超过预期基因数,“Signal transduction”、“Cell structure and motility”、“Cell proliferation and differentiation”、“Cell cycle control”等17个BP分类的P<0.05。下调基因共参与109个BP分类,92个分类超过预期基因数,只有“Lactation,mamary development”分类的P<0.05。上调基因共参与254个MF分类,99个分类超过预期基因数,“Actin binding cytoskeletal protein”、“Cytoskeletal protein”、“Signaling molecule”和“Extracellular matrix”4个分类的P<0.05。下调基因共参与103个MF分类,其中95个分类超过预期基因数,但P>0.05。

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