动物源性食品中细菌的检测——大肠埃希氏菌

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大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，E.coli）习惯上称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80%～87%。大肠杆菌常见于人和动物的肠道内，大多数血清型的大肠杆菌并不致病，而且是肠道内常在的有益菌。

致病性大肠杆菌是通过环境污染进入食品中的，有些血清型的致病性大肠杆菌感染食品，某些菌株具有毒性（其中一些类似导致痢疾的毒素），可以导致食物中毒，这通常是因为食用了被污染的肉类产品等（通常是屠宰过程或储藏贩卖过程中的污染所致）。疾病的严重程度可以相差很多，尤其对儿童、老人和免疫缺失病人可以是致命的，但通常是温和的。大肠杆菌的内毒素可能对热稳定或不稳定，其结构和功能与霍乱毒素相当接近，全毒素包含1个A亚基和5个B亚基，B亚基起黏附作用，使毒素进入肠道细胞，而A亚基断裂出来，使得细胞脱水引起腹泻。不同的大肠杆菌菌株生活在不同动物中，因此可以通过其判断粪便来源于人或者鸟类等。通过突变，新的大肠杆菌菌株不断出现，其中一些可能对宿主动物造成损害。尽管对于大多数健康成年人，这样的菌株可能只引起一次腹泻，或者根本没有症状，但对于幼儿、大病初愈的人或者进行某些药物治疗的人来说，陌生的菌株可能引起严重疾病甚至死亡。

与人类疾病有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，一般包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和黏附性大肠杆菌（EAEC）。肠出血性大肠杆菌O157：H7就是一个毒性很强的菌株，属埃希氏菌属的一种血清型。在1982年，美国首次从汉堡包集体食物中毒事件中发现食物中毒由大肠杆菌所致，大约10个细菌即可导致感染，这是迄今为止能引起食物中毒的最小菌量。致病性大肠杆菌可经带菌人的手、食物和生活用品进行传播，也可经空气或水源传播。带菌食品由于加热不彻底或因生熟交叉污染或熟后污染而引起食物中毒。另外，大肠杆菌耐酸，即便在胃的酸性条件下也能存活。它在水中生存的时间相当长。美国每年约有20000人染上肠出血性大肠杆菌病，其中约有50人死于该病。大肠杆菌是美国碎牛肉中必须控制的目标菌。

1、病原学特征

大肠杆菌为革兰氏阴性短杆菌，大小为0.5μm×（1～3）μm。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类，产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成B族维生素和维生素K及有杀菌作用的大肠杆菌素。大肠杆菌在正常栖居条件下不致病，但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几乎占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出该菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）。

大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），表面抗原有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泻和成年人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行试验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础及基因工程的研究。

该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55℃经60min或60℃加热15min仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。该菌对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药，是由带有R因子的质粒转移而获得的。

2、流行病学特征

大肠杆菌是人和动物肠道等处的常在菌，1g粪便中约含有106个菌。该菌在饮水中出现被认为是粪便污染的指标。禽大肠杆菌在鸡场中普遍存在，特别是鸡舍通风不良、大量积粪时，在垫料、空气尘埃、污染用具和道路，粪场及孵化厅等处环境中染菌量最高。大肠杆菌随粪便排出，并可污染蛋壳或从感染的卵巢、输卵管等处侵入卵内，在孵育过程中使禽胚死亡或出壳发病和带菌，是该病传播过程中重要途径。带菌禽以水平方式传染健康禽，消化道、呼吸道为常见的传染门户，也可经生殖道造成传染。啮齿动物的粪便常含有致病性大肠杆菌，可污染饲料、饮水而造成传染。禽大肠杆菌病主要发生在密集化养禽场，各种禽类不分品种、性别、日龄均对该菌易感。特别是幼龄禽类发病率最高，如污秽、拥挤、潮湿通风不良的环境，过冷过热或温差很大的气候，有毒有害气体（氨气或硫化氢等）长期存在，饲养管理失调，营养不良（特别维生素的缺乏）以及病原微生物（如支原体及病毒）感染所造成的应激等均可促进该病的发生。

人可通过饮用受污染的水或食用未熟透的食物（特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉）而感染，出现腹泻等症状。饮用或食用未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及奶酪而染病的个案亦有发现。此外，若个人卫生欠佳，亦可能会通过人传人的途径，或经食用受粪便污染的食物而感染该种病菌。

由于大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体中排出，广泛散播于自然界，所以一旦检出大肠杆菌，即意味着所检样品直接或间接地被粪便污染，因此卫生学上被用于作为饮水、牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌（例如沙门氏菌、志贺氏菌）的存在，因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。有些国家在执行危害分析和关键控制点（HACCP）管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

3、危害

致泻性大肠杆菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为引起的腹泻数量始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。另外，致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季节为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上。近来，EHEC O157：H7被WHO定为新的食源性致病菌，其可引发出血性肠炎的暴发或散发。1982年美国首次报道了由肠出血性大肠杆菌O157：H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，感染数并有上升趋势。1996年在日本发生的肠出血性大肠杆菌O157：H7的暴发流行引起了出血性腹泻，先后波及日本30多个都、府、县，感染近万人，并造成12人死亡，引起了全世界的关注。此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地区也相继报道了肠出血性大肠杆菌O157：H7的散发性感染和暴发流行。日本、加拿大及瑞士等国家已将肠出血性大肠杆菌O157：H7列为必须报告的传染病，予以高度重视。我国于1988年首次分离到肠出血性大肠杆菌O157：H7，从已有的流行病调查资料来看，我国亦存在肠出血性大肠杆菌O157：H7的散发，但尚未有暴发流行的报道。

4、国内外卫生要求

美国联邦法规中规定大肠杆菌在鸡肉、牛肉和猪肉中的限量分别为m＝100CFU/cm2、M＝1000CFU/cm2（鸡肉），m≤5CFU/cm2、M＝100CFU/cm2（牛肉），m＝10CFU/cm2、M＝10000CFU/cm2（猪肉）；（m是指合格菌数限量，M是指附加条件后合格菌数限量）加拿大在新鲜或冷冻禽肉标准中规定大肠埃希氏菌的限量为m＝10CFU/cm2、M＝1000CFU/cm2；欧盟的食品微生物法规汇编中规定碎肉或冷冻碎肉中的大肠埃希氏杆菌的限量为m＝50CFU/cm2、M＝500CFU/cm2；澳大利亚食品标准法规中规定生乳或未经巴氏消毒的乳中大肠杆菌的限量为m＝3CFU/mL、M＝9CFU/mL。在我国的动物源性食品标准中，除了冻禽产品标准中规定了致泻性大肠杆菌不得检出外，其他所有相关标准只是规定了大肠菌群的限量标准。

5、检测方法

包括病原的分离鉴定及分子生物学方法、免疫学方法等。

5.1 细菌分离鉴定方法

5.1.1 增菌

以无菌操作将待检样品放入营养肉汤中均质，制成悬液，于（36±1）℃培养16h。

5.1.2 分离

将肉汤增菌液接种于麦康凯或伊红美蓝琼脂平板上；污染严重的样品，制成悬液后可直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板；也可接种于显色培养基上，于（36±1）℃培养16～20h，观察菌落。从每个平板上至少挑取2个可疑菌落，用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，于（36±1）℃培养18～24h，以备进行生化试验。

5.1.3 革兰氏染色

取18h营养琼脂斜面培养物做革兰氏染色、镜检，大肠杆菌为革兰氏阴性杆菌。

5.1.4 生化鉴定

挑取营养琼脂斜面菌落分别接种于三糖铁琼脂、蛋白胨水、半固体、pH7.2尿素琼脂、氰化钾肉汤，并置（36±1）℃温箱中培养过夜。

三糖铁底层产酸，硫化氢阴性，氰化钾阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。

5.1.5 血清学分型

挑取经生化试验证实为大肠杆菌的菌落，用大肠杆菌多价O血清和肠出血性大肠杆菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做凝集试验。

5.2 生化鉴定试剂盒方法

API20E试验条由20个含干燥底物的小管所组成。这些测定管用细菌悬浮液接种。培养一定时间后，通过代谢作用产生颜色的变化，或是加入试剂后变色而观察其结果。

挑取营养琼脂斜面上单个纯菌落于灭菌纯水中，制成菌悬液。按照生化鉴定试剂盒操作说明，将菌悬液加入20E反应条的各反应孔内，放入反应槽中，置37℃温箱中培养24h。取出后根据说明书观察反应结果，在软件上记录结果，系统将自动出现检测结果。所得反应的类型必须以数字化形式记录在报告单中，每3个测定为一组，每个以1、2和4标明，在每组中，阳性反应以相应的数字相加，由API20E的20个测定可得一个7位数。

5.3 分子生物学方法

从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用无菌去离子水制成菌悬液，水浴煮沸10分钟，3000r/min离心，以上清液为模板，进行扩增。上游引物为5′-TGT TCA GTG GCA AGA GTT-3′，下游引物为5′-TAA TCG ATA TAC CCG CTC-3′；扩增体系：10×buffer5μL，Taq DNA聚合酶（2U/μL）1μL，氯化镁溶液（25mmol/L）5μL，dNTP（2.5mmol/L）5μL，双蒸水（ddH2O）29μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，模板1μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共作用36个循环。PCR产物用15%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为353bp的扩增产物，可鉴定该菌为大肠杆菌。

5.4 VIDAS鉴定肠出血性大肠杆菌O157方法

VIDAS鉴定肠出血性大肠杆菌O157（ECO）方法是一种在自动VIDAS仪器上进行的酶联荧光免疫分析的方法。其原理是：煮沸过的增菌肉汤加入试剂条孔后，在特定时间内，样品在固相容器（用抗肠出血性大肠杆菌O157抗体包被一个类似于加样头的一次性使用装置）内、外反复循环。样品中的O157抗原与包被在固相容器内部的O157抗体结合，未结合的其他成分通过洗涤步骤清除。标记有碱性磷酸酶的抗体也在固相容器内、外循环并与固定在固相容器壁上的肠出血性大肠杆菌O157抗原结合，最后洗去未结合的抗体标记物。仍结合在固相容器壁上的酶将催化底物转变成具有荧光的产物4-甲基伞形酮，在VIDAS中由光扫描器在450nm处检测其荧光强度，试验完成后由计算机自动分析结果，得出检测值，并打印出每份样品的试验报告。其检测步骤如下：

挑取肠出血性大肠杆菌O157可疑菌落，放入1mL无菌纯水中制成菌悬液，或直接取1mL培育24h的增菌液，置水浴锅中95～100℃煮沸15min后，冷却至室温，同时设质控对照并煮沸、冷却，以备检测。

（1）将所需试剂取出，使其恢复至室温（至少30分钟）。

（2）每个样品使用一条ECO试剂条及一个ECO固相容器，先必须做好质控和校正。确保取出试剂后，将装有剩余固相容器的袋子重新密封好。

（3）输入所需的信息以便建立工作列表（work list），键入“ECO”至检测编号，再输入将要检测的试验号。标准（S1）必须在work list的首位并做双份，随后是质控（C1和C2）。

（4）使用前彻底混匀标准、质控及灭活的样品。准确吸取500μL以确保测试的正确性。

（5）吸取500μL的质控及灭活的样品至ECO试剂条样品孔的中央。

（6）依屏幕所示，将固相容器和试剂条放入仪器的相应位置。核对位置，以确保固相容器上3个字母编码的颜色标记与试剂条相符。

（7）检测结束后，仪器自动打印检测结果。

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