NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞的应用与培养！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/03/12 16:03

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NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞的应用与培养！

一、背景

NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系是一种人非小细胞肺癌贴壁细胞系，通常在生物学和医学研究中被用于体外实验。这种细胞系可以用于研究肺癌的发病机制、药物筛选和毒性测试等。

二、NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞培养操作

1)复苏NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于肿瘤新标志物CAPS和ASCL2的预后意义和相关机制研究：

ASCL2在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义背景:肺癌是目前世界上第二大肿瘤类型,其病人约占所有肿瘤病人的13.3%。在因肿瘤导致的死亡中,肺癌约占26.8%,位居所有肿瘤之首。ASCL2是碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)转录因子家族的成员之一,在胎盘滋养层细胞的发育以及神经前体细胞形成过程中发挥了重要的调节作用。

近年来有研究显示,ASCL2在结直肠癌、胃癌组织中异常高表达,并与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭迁移、上皮-间质转化、干性维持等过程密切相关。但ASCL2在肺癌中的表达及其功能尚不明确。

基于此,检测了肺鳞状细胞癌和肺腺癌中ASCL2的表达,评估了其临床病理学意义,并比较了ASCL2在鳞状细胞癌和腺癌中表达和临床意义的差异。

方法和结果：

1、采用免疫组织化学(immunohistochemical,IHC)染色的方法检测10例正常肺组织、79例SCC组织及67例AC组织中ASCL2的表达情况。结果显示,ASCL2在SCC(5.89±2.79vs.2.40±1.02,p<0.001)和AC(4.78±2.92 vs.2.40±0.92,p=0.014)中的表达均显著高于正常组织,且SCC中ASCL2的表达亦显著高于AC中的表达(5.89±2.79vs.4.78±2.92,p=0.002)。

2、ASCL2的表达与SCC的TNM分期(p=0.010)、分化程度(p=0.010)密切相关。而在AC中,ASCL2的表达只与患者的临床分期(p=0.018)呈正相关,而与患者的年龄、性别、吸烟与否、分化程度无明显相关性(均p>0.05)。

3、Kaplan-Meier生存分析法比较ASCL2高表达(ASCL2high)组患者与ASCL2低表达(ASCL2low)组患者的预后。

结果显示,ASCL2high组SCC患者的总体生存率显著低于ASCL2low组SCC患者(p=0.004)。ASCL2low组的SCC患者的中位生存时间为(74.8月,95%CI65.9-83.7),明显长于ASCL2high组SCC患者的中位生存时间(53.3月,95%CI43.4-63.2)。多因素回归分析结果亦显示,ASCL2的表达水平可作为SCC患者独立的预后因素(HR=2.692,p=0.041)。然而在AC患者中,ASCL2的表达水平与预后并没有显著相关性(p=0.172),也不能作为患者独立的预后指标(HR=1.528,p=0.256)。

4、对TCGA数据库中的资料进行归纳,筛选出有完整随访资料的351例SCC标本,439例AC标本,以及50例正常支气管上皮标本和58例正常肺泡上皮标本。分析显示,在正常支气管上皮、正常肺泡上皮、SCC及AC组织中ASCL2mRNA表达水平分别为-0.65±0.68、0.97±1.44、-0.4±0.81及-0.04±1.47。SCC和AC组织中ASCL2 mRNA的表达水平均显著高于其对应的正常上皮组织(p<0.001和p=0.006),并且SCC组织中ASCL2的表达亦显著高于AC中的表达(p<0.001)。生存分析显示,ASCL2high组SCC患者的预后明显差于ASCL2low组患者(p=0.015),但AC患者的预后与ASCL2的表达水平未见明显相关性(p=0.165)。

5、免疫组化结果显示ASCL2主要表达于细胞浆中,与之前报道的ASCL2作为转录因子主要定位于细胞核相左。我们进一步用免疫荧光的方法检测了肺癌细胞及冰冻组织中ASCL2的定位情况。

结果显示,在正常支气管上皮细胞株HBE,肺腺癌细胞株A549,NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系和肺大细胞癌细胞株NCI-H460和冰冻组织中ASCL2的荧光染色信号均主要定位于细胞浆。该结果提示ASCL2在细胞中的定位可能具有细胞类型依赖性。

结论：SCC和AC组织中ASCL2的表达水平显著高于其对应的正常组织,且相比于AC组织中的表达水平,SCC组织中ASCL2的表达水平显著增加。在SCC患者中,ASCL2的表达与临床分期及分化程度密切相关,并可以作为患者独立的预后指标。此外,ASCL2在肺癌组织中主要表达于细胞浆。

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