人结肠腺癌细胞的知识与应用及培养操作步骤!
一、背景
人结肠腺癌细胞是LS 180(ATCC CL 187)结肠腺癌细胞株的胰蛋白酶化变种。它比亲本更易传代,和LS 180一样生成大量的癌胚抗原(CEA)。电镜研究表明有丰富的微丝和细胞质粘液素液泡。直肠抗原3阳性。p53抗原表达阴性,但mRNA表达阳性。与ATCC CL-187来源于同一个肿瘤。LS 174T细胞角蛋白染色阳性。癌基因c-myc,N-myc,H-ras,N-ras,Myb,和fos的表达呈阳性。癌基因k-ras和sis的表达未做检测。
二、人结肠腺癌细胞培养步骤
1、人结肠腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备:
1)准备:DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培养条件:气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度,培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液:50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
2、人结肠腺癌细胞处理:
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入250px皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞,传代可参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注:次传代推荐传代比例为1:2,以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3)人结肠腺癌细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例;
1.细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入2ml完全培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2.1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮,加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀,按每1ml的数量分配到冻存管中,注意冻存管做好标识。明舟生物(mingzhoubio)按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
人结肠腺癌细胞可以用于MiR-492调控CD147表达对结肠癌细胞LS174T奧沙利铂耐药性的影响的研究:
研究建立了奥沙利铂耐药结肠癌S174T/L-OHP细胞系,运用该细胞系开展体外实验,可以简化并很好的模拟结肠癌对奥沙利铂耐药的发展。利用此细胞系深入研究耐药的分子机制,可能有助于发展有效治疗方式,将耐药肿瘤细胞逆转为对化疗敏感的细胞。进而发展新型靶向治疗,攻克肿瘤细胞对化疗耐药的问题,这也正是目前结肠癌治疗的一个热点。
研究通过开展体内外细胞生长实验,旨在阐明miR-492/CD 147轴在结肠癌细胞奥沙利铂耐药中的关键功能调控作用。研究结果提示miR-492通过调节CD147,促进结肠癌对奥沙利铂的耐药。CD147可能成为对抗结肠癌奥沙利铂耐药的一个新型治疗靶点。
方法:
1、建立LS174T/L-OHP寸药细胞系本实验所采用的方法是逐步递增培养液中L-OHP浓度、间歇作用于人结肠腺癌细胞,对其进行体外诱导筛选而获得。应用MTT法分别检测倍比稀释浓度的L-OHP对其细胞的抑制率,进而确认所建立细胞系具有良好的耐药性和稳定性。
2、分析Mi R-492/CD147在结肠癌细胞LS174T及耐药细胞LS 174T/L-OHP中的表达实时PCR分析LS 174T/L-OHP和LS174T细胞内miR-492和CD147的mRNA表达水平。Western blot检测LS 174T/L-OHP和人结肠腺癌细胞中CD147的表达水平。揭示miR-492/CD147可能参与人结肠腺癌细胞对奥沙利铂耐药的过程。
3、敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达对LS 174T/LOHP细胞耐药性的影响RNA干扰技术敲低LS 174T/L-OHP细胞CD147表达后,MTT实验结果检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性的影响。
4、下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达对CD147蛋白水平的影响。
5、上调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492表达对CD147蛋白水平的影响转染pre-mi R-492外源性上调miR-492,检测LS174T/L-OHP细胞中CD147蛋白含量,双荧光素酶检测CD147 3’-UTR的启动子荧光素酶活性,进而MTT法检测LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的耐药性。
6、体内实验用裸鼠肿瘤耐药细胞,外源性上调miR-492,检测其对CD147的调控作用,同时监测肿瘤体积来揭示miR-492/CD147对肿瘤细胞耐药性的影响。
结果:在本研究中,发现与对照组结肠癌LS174T细胞相比,奥沙利铂耐药细胞LS 174T/L-OHP中miR-492的表达水平较低,CD147的表达水平则更高。在LS 174T-L-OHP中,我们还发现敲低CD147可以增强LS 174T/L-OHP细胞对奥沙利铂的敏感性。
采用miRNA抑制体转染LS 174T/L-OHP细胞的方法,下调LS 174T/L-OHP细胞中miR-492的表达,CD147表达水平升高;外源性导入pre-miR-492上调miR-492,可以下调CD147的表达水平,同时提高肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性。此外,给奥沙利铂耐药移植瘤注入miR-492,能够提高耐药细胞对药物的响应。
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