UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)的培养操作规程！

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2024/04/17 16:16

UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)的培养操作规程！

一、背景

UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)也被称为大鼠骨肉瘤细胞，是一种通过注射放射性同位素磷(32P)诱导产生的可移植性大鼠骨肉瘤克隆而建立的细胞株。这种细胞对甲状旁腺激素（PTH）、前列腺素以及破骨甾体有响应。值得注意的是，与相关的细胞株UMR-108相比，UMR-106对PTH的响应度更高。蛋白激酶C的活化能够抑制ATP诱导的胞内钙水平的升高。

这种细胞通常在特定的培养基中生长，如DMEM培养基，并需要添加胎牛血清以提供必要的生长因子和营养物质。培养条件包括适宜的温度（通常是37摄氏度）和特定的气体环境（如空气和二氧化碳的混合气体）。

UMR-106细胞株的建立和研究为骨肉瘤和其他相关领域的科学研究提供了有价值的实验模型。通过对这种细胞的研究，科学家们可以深入了解骨肉瘤的发生机制、发展过程以及潜在的治疗方法。此外，这种细胞也常用于药物筛选和毒性测试等实验研究中。

二、UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)培养操作

1)复苏UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)可以用于KISS1/GPR54系统对大鼠骨肉瘤UMR-106细胞及原位移植瘤模型的作用：

目的：

1、构建大鼠骨肉瘤“原位移植-肺转移”模型，为研究KISS1/GPR54系统对大鼠骨肉瘤的影响构建实验平台。

2、检测KISS1/GPR54系统在大鼠骨组织和骨肉瘤模型中的表达。

3、研究KISS1的多肽片段对骨肉瘤UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)细胞迁移、侵袭能力的影响。

4、构建大鼠KISS1基因重组慢病毒并感染UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)，获得稳定表达外源性KISS1基因的UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)106细胞。5.探讨大鼠KISS1基因修饰对于大鼠骨肉瘤的影响及可能机制。

方法：

1、使用钡剂测定大鼠胫骨骨髓腔容积，向骨髓腔内注射适量的大鼠骨肉瘤UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)细胞悬液，观察胫骨原位肿瘤生长和肺部转移情况，应用RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OPN）在细胞、原位肿瘤和肺转移结节中的表达

2、采用RT-PCR法和Western Blot法，从mRNA水平和蛋白水平检测KISS1和GPR54在大鼠骨组织、UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)、裸鼠模型的原位肿瘤组织中的表达情况。

3、采用50nM、100nM、200nM三个剂量的Kp-10（Kisspeptin10肽片段）作用于UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)单细胞层，划痕实验和Transwell实验分别观察细胞迁移和侵袭能力的变化。

4、构建携带大鼠KISS1基因的重组慢病毒并感染UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)，通过荧光表达法判定感染复数（Multiplicities of Infection,MOI），Western Blot检测感染前后的细胞中KISS1蛋白的表达情况。

5、体外实验：划痕实验和Transwell实验测定转染前后各组细胞的迁移、侵袭能力的变化。Western Blot检测转染前后各组细胞MMPs，TIMPs的表达变化。体内实验：观察转染前后各组细胞原位模型的肿瘤大小和肺转移结节的数量。

结果：

1、建立了骨肉瘤“原位移植-肺转移”模型。UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)、原位肿瘤和肺转移结节中均表达骨肉瘤标记物ALP、OPN。

2、KISS1mRNA和蛋白在UMR-106细胞中表达很低，在荷瘤鼠的原位肿瘤中表达极低，在骨组织中的表达量低于肝组织。GPR54在上述组织中均有表达。

3、Kp-10作用后的UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)的迁移距离缩短，穿膜细胞数量减少（P<0.05）。

4、构建了大鼠KISS1基因重组慢病毒载体，感染UMR-106(大鼠骨肉瘤细胞)最佳MOI值为20。转染后的UMR-106细胞KISS1蛋白的表达量明显增加，并能持续表达40天以上。

5、体外实验：转染KISS1基因的UMR-KISS1细胞的迁移距离缩短和穿膜细胞数量减少，MMP-2、MMP-9的表达量降低，TIMP-1、TIMP-2的表达量升高。体内实验：UMR-KISS1组裸鼠模型的原位肿瘤体积缩小，肺转移结节数量减少。

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