MDA-MB-435人乳腺癌细胞的性质与用途及生产工艺！

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一、背景

MDA-MB-435人乳腺癌细胞系是一种来源于人类乳腺癌的细胞系，具有高度的增殖能力和侵袭性。它是由MDA-MB-231细胞株经过连续传代培养而得到的亚克隆细胞系，具有与原株相似的形态学和生物学特性。

MDA-MB-435人乳腺癌细胞系在乳腺癌研究中具有重要的应用价值，因为它可以模拟人类乳腺癌的生长和转移过程，为研究乳腺癌的发生机制、诊断和治疗提供了重要的实验模型。此外，MDA-MB-435人乳腺癌细胞系系还可以用于筛选抗肿瘤药物、评估药物疗效和毒副作用等研究。

二、MDA-MB-435人乳腺癌细胞系培养操作

1)复苏MDA-MB-435人乳腺癌细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)MDA-MB-435人乳腺癌细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)MDA-MB-435人乳腺癌细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

MDA-MB-435人乳腺癌细胞系可以用于咖啡酸3，4-二羟基—苯乙基酯诱导乳腺癌细胞凋亡的作用研究：

采用人乳腺癌细胞系，探讨了CADPE的抗乳腺癌作用及其相关机制，发现CADPE可以抑制乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡，并有望成为有效的生长因子拮抗剂。

方法：

（一）乳腺癌细胞增殖人乳腺癌细胞系MCF-7、MCF-7ADR、MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系体外培养，同时添加CADPE处理细胞，采用单细胞增殖检测试剂盒检测乳腺癌细胞增殖情况。

（二）乳腺癌细胞凋亡检测Hoechst33342染色法、流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD双染色检测CADPE作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系的形态学变化及凋亡率。

（三）乳腺癌细胞线粒体凋亡途径相关测定采用不同浓度CADPE作用于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系，利用DCFH-DA（细胞活性氧检测探针）测定细胞内的活性氧变化，JC-1法测定线粒体膜电位改变，Western blot检测caspase-3，Bcl-2和Bax蛋白表达。

（四）生长因子受体及相关酪氨酸激酶磷酸化检测Western blot方法检测CADPE对VEGF、EGF、PDGF、HGF刺激的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系VEGFR、EGFR、Src及C-Met磷酸化水平的影响。

（五）Her-2、c-myc及maz蛋白表达分析Western blot方法检测CADPE处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系后Her-2、c-myc及maz蛋白表达。

（六）裸鼠体内荷瘤实验将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞接种裸鼠皮下，待成瘤后，每周两次腹腔注射2.5mg/kg的CAPDE，观察CADPE对肿瘤生长及裸鼠体重影响。

结果：

（一）CADPE抑制乳腺癌细胞增殖采用CADPE处理乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCF-7和MCF-7ADR细胞，结果显示CADPE10～80μmol/L的CADPE作用24h、48h和72h，均能明显抑制乳腺癌细胞增殖。

（二）CADPE诱导乳腺癌细胞凋亡采用Hoechst33342染色乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系，荧光显微镜下观察CADPE处理后细胞形态变化，结果显示存在细胞核浓缩等细胞凋亡特征。Annexin V-PE/7-AAD双染色结果显示20μmol/LCADPE作用48小时后细胞的凋亡率较对照组显著增高（p<0.01）。

（三）CADPE促进乳腺癌细胞活性氧产生CADPE（0～80μmol/L）处理人乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-435人乳腺癌细胞系48h，结果显示CADPE能明显增加细胞内活性氧（ROS）产生。

（四）CADPE降低乳腺癌细胞线粒体膜电位JC-1法测定线粒体膜电位，结果显示CADPE处理后乳腺癌细胞的线粒体膜电位明显降低。

（五）CADPE对乳腺癌细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2表达的影响Western blot检测结果显示CADPE处理后乳腺癌细胞Caspase-3和Bax表达上调，而Bcl-2表达下调。

（六）CADPE抑制配体刺激的乳腺癌细胞VEGFR、EGFR及C-Met磷酸化MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系分别经相应配体刺激后，VEGFR、EGFR、Src、C-Met磷酸化增加，而预先使用CADPE处理组，VEGFR、EGFR和C-Met磷酸化水平相对未处理组增幅较小，但CADPE对Src磷酸化水平无明显影响。

（七）CADPE影响乳腺癌细胞EGFR磷酸化的时间及剂量依赖性MDA-MB-435人乳腺癌细胞系经EGF刺激后，EGFR磷酸化水平增高，这种作用随CADPE孵育时间延长或者CADPE浓度增加而降低。

（八）CADPE抑制乳腺癌细胞Her-2、c-myc及maz蛋白表达CADPE处理乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435人乳腺癌细胞系后，可以降低Her-2、c-myc及maz蛋白表达。

（九）CADPE对裸鼠体内乳腺癌细胞瘤生长的影响裸鼠接种乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞成瘤后，给予CADPE处理，第38d、42d肿瘤体积明显小于对照组（P＝0.046,0.025），两组瘤重差别具有统计学意义（P＝0.017），但两组小鼠体重的变化无明显差别。

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