184A1人乳腺上皮细胞系的应用及培养操作步骤！

北京百欧博伟生物技术有限公司

2024/04/30 15:52

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184A1人乳腺上皮细胞系的应用及培养操作步骤！

一、背景

184A1人乳腺上皮细胞系是一种常用的细胞系，被广泛应用于乳腺上皮细胞相关的基础研究和应用研究。以下是关于该细胞系的一些基本信息：

背景：184A1细胞系来源于一名女性乳腺癌患者的手术标本，并通过一系列的传代培养而建立。这些细胞形态上类似于正常的乳腺上皮细胞，但具有无限增殖的能力。

形态特征：上皮细胞样。

培养条件：通常需要在37°C、5%CO2和95%湿度的条件下进行培养，并使用特定的培养基进行营养支持。

用途：广泛用于研究乳腺癌的发生、发展、治疗和预防等方面，以及测试新的药物和治疗方法的效果。

二、184A1人乳腺上皮细胞系培养操作

1)复苏184A1人乳腺上皮细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)184A1人乳腺上皮细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)184A1人乳腺上皮细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

三、应用

184A1人乳腺上皮细胞系可以用于趋化因子受体CCR7在乳腺癌细胞转移中的机制探讨：

利用RNA干扰技术,以乳腺癌细胞为研究对象,下调乳腺癌细胞系中的基因CCR7的表达对乳腺癌细胞转移的影响,并行蛋白质谱检测,研究沉默CCR7后哪些蛋白和信号分子参与CCR7的调控作用,对探讨CCR7与乳腺癌转移的内在机制,发现新的诊断标记物及治疗靶点具有积极的意义。

方法：

1、常规培养乳腺癌细胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮细胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A,用q-PCR和Westen blot实验筛选出高表达CCR7的乳腺癌细胞系。

2、对筛选出来的乳腺癌细胞株进行转染,提取实验组(CCR7-siRNA)和对照组的总RNA和总蛋白,用q-PCR和Western blot检测干扰效果。

3、利用划痕实验和transwell小室迁移实验检测了siCCR7转染对乳腺癌细胞迁移的影响。

4、通过蛋白质谱结果筛选出差异表达蛋白,并用q-PCR验证参与CCR7的调控作用关键蛋白。

结果：

1、高表达CCR7的乳腺癌细胞系的筛选q-PCR结果显示:人乳腺癌细胞株T47D、HCC1500、SK-RB-3、BT474、MCF7的CCR7的mRNA表达水平较其他乳腺癌细胞株高。高表达CCR7的乳腺癌细胞系的筛选Western blot结果显示:CCR7在小鼠乳腺癌细胞株4T1-Luc、人乳腺癌细胞株T74D、MCF7中高表达,在部分乳腺癌细胞株中如MB231、MB468、HCC1937中有较高水平的表达。但是在正常乳腺细胞株如184B5、184A1人乳腺上皮细胞系和MCF10A中几乎无CCR7表达。最后我们选取MCF7及T47D乳腺癌细胞进行后续的实验。

2、T47D、MCF7细胞在经过siRNA处理后,通过q-PCR检测对T47D、MCF7乳腺癌细胞的沉默效应,结果显示CCR7-siRNA和CCR7-siRNA能非常有效地抑制T47D、MCF7细胞中内源性CCR7的mRNA水平的表达。Western blot得到相似的结果。

3、乳腺癌细胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮细胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A划痕实验和transwell小室迁移实验结果均表明,与shLacZ组比,shCCR7C组和shCCR7D组乳腺癌细胞迁移能力变弱。

4、乳腺癌细胞系MDA-MB-231、4T1-luc、MDA-MB-361、T47D、MDA-MB-468、MCF-7、MCF10A、184B5、184A1人乳腺上皮细胞系、HCC1806、HCC1937、HCC1580、MCF10A通过蛋白质谱结果筛选出差异表达蛋白如下:EPHA2、PVR、SQSTM1、ANXA6、PTRF、ALDH3A2、EPCAM。并用q-PCR方法及Western blot方法验证沉默CCR7后ALDH3A2和PTRF可能参与CCR7的调控作用。

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