JHH-7人肝癌细胞系的性质与用途及生产工艺！

                    JHH-7人肝癌细胞系的性质与用途及生产工艺！

一、背景

JHH-7人肝癌细胞系是一种人肝癌细胞系，由日本千叶医科大学肝癌研究所建立。这种细胞系被广泛应用于肝癌研究，包括肝癌的发病机制、药物治疗、基因表达谱等方面的研究。

JHH-7细胞系具有稳定的生长特性和形态特征，可以通过传代培养不断增殖。这种细胞系可以作为体外模型来研究肝癌的生长和转移，也可以用于药物筛选和基因治疗等方面的研究。

HH-7人肝癌细胞系是一种人类肝癌细胞系，它是由人肝癌组织中分离出来的。这种细胞系在医学研究中被广泛使用，因为它可以用于研究肝癌的生物学特性、药物筛选和治疗等。

二、JHH-7人肝癌细胞系具有以下特点

形态特征：JHH-7人肝癌细胞系呈多边形或长方形，大小不一，通常有较多的突起和伪足。

生长特性：JHH-7人肝癌细胞系生长迅速，可以在体外培养条件下持续传代。

耐药性：JHH-7人肝癌细胞系对多种化疗药物具有耐药性，这使得它成为研究肝癌耐药性的重要工具。

表达谱：JHH-7人肝癌细胞系表达多种与肝癌相关的基因和蛋白质，如AFP、CEA、CK19等。

应用前景：JHH-7人肝癌细胞系在肝癌的诊断、治疗和预防方面具有广阔的应用前景。

三、JHH-7人肝癌细胞系细胞培养操作

1)复苏JHH-7人肝癌细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)JHH-7人肝癌细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)JHH-7人肝癌细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

四、应用

JHH-7人肝癌细胞系可以用于生物钟基因PER1调节脂质代谢对西黄丸抗肝癌效应的影响：

探究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中生物钟基因PER1与脂质代谢的关系、综合评价西黄丸抗肝癌效应及生物钟基因PER1对西黄丸抗肝癌效应的影响。

方法：

1、生物钟基因PER1与HCC脂质代谢相关研究:通过RT-PCR及Western Blot实验检测课题组五种HCC细胞株(JHH-7人肝癌细胞系、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、HLF)中生物钟基因PER1表达量。使用搭载PER1沉默慢病毒(shPER1#1#2#3)及搭载空载质粒慢病毒(PER1-NC)转染PER1表达量最高HCC细胞株,体外构建生物钟基因PER1沉默稳转株。验证转染效率后,提取实验组细胞mRNA,检测AMPK、SREBP-1、ACC1、SCD1的表达情况。油红O染色检测细胞内脂滴含量。CCK-8检测PER 1沉默后HCC细胞的增殖情况。为进一步探讨PER 1调控HCC脂质代谢的分子机制,设置空载质粒组(NC组)、PER1沉默组(shPER1组)、shPER 1+AMPK抑制剂组(Compound C组),使用Western Blot检测AMPK、p-AMPK、SREBP-1及其下游脂代谢关键酶类的蛋白表达水平。

2、西黄丸抗肝癌效应研究:采用50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、4 0 0μg/mL西黄丸萃取液作用于HCC细胞(JHH-7人肝癌细胞系、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、HLF),CCK-8实验检测24h、48h、72h后450nm处OD值,并绘制细胞增殖曲线;集落实验检测西黄丸对HCC细胞的集落生成率的影响;划痕实验检测西黄丸对HCC细胞的迁移率的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测西黄丸对HCC细胞侵袭转移能力的影响;流式细胞仪和Annexin-V/PI法检测西黄丸对HCC细胞凋亡率的影响。

3、生物钟PER1影响西黄丸抗肝癌效应研究:设置对照组、空载质粒组(NC组)、PER1沉默组(shPER1组),400μg/mL西黄丸萃取液作用于NC组及shPER1组。CCK-8、集落实验检测三组实验细胞增殖能力;划痕、Transwell实验检测三组实验细胞迁移及侵袭转移能力。

4、西黄丸调节生物钟基因PER1研究:选取生物钟基因PER1表达量最高及最低的两株HCC细胞(JHH-7人肝癌细胞系、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、HLF),分别使用5 0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL西黄丸萃取液进行干预。提取实验组细胞mRNA及蛋白后,RT-PCR及Western Blot检测生物钟基因PER1的表达量。

结果：RT-PCR及Western Blot实验结果表明,HCC细胞株JHH-7人肝癌细胞系的PER1表达量最高,HLF的PER1表达量最低(P<0.0001);选取JHH-7体外构建PER 1沉默稳转株并验证其转染效率。与NC组相比,shPER1能显著降低PER1的mRNA及蛋白水平(P<0.0001)。利用构建成功的PER1沉默稳转株进行后续实验,结果显示,沉默PER1后,AMPK的mRNA表达水平下调,SREBP-1、ACC1、SCD1的mRNA表达水平上调;油红O染色结果显示,PER1沉默后HCC细胞中脂滴含量增多(P<0.001);CCK-8实验结果显示,PER1沉默后,HCC细胞的增殖能力提高(P<0.05);进一步检测蛋白层面的表达情况,结果显示,沉默PER 1后,AMPK蛋白水平无明显变化,p-AMPK蛋白下调,SREBP-1及其下游脂代谢关键蛋白ACC1、SCD1的表达上调。加入Compound C抑制AMPK磷酸化后,p-AMPK、SREBP-1、ACC1、SCD1的蛋白表达被逆转。

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