铜绿假单胞菌的实验室检查与生化鉴定及预防方法!
一、知识简介
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛,为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有此菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。
二、生物学特性
铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌,属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛,在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
铜绿假单胞菌为专性需氧菌,最适生长温度为25~30℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素,如绿脓素(pyocynin)与带荧光的水溶性荧光素(pyoverdin)等。在血平板上会有透明溶血环。
该菌含有O抗原(菌体抗原)以及H抗原(鞭毛抗原)。O抗原包含两种成分:一种是其外膜蛋白,为保护性抗原;另一种是脂多糖,有特异性。O抗原可用以分型。
三、实验室检查
1、标本来源
采自不同感染部位的各种标本,包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。
2、染色镜检
为革兰阴性杆菌,菌体大小(1.5~5.0)um×宽(0.5~1)um,细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。菌体的一端有单鞭毛,无芽胞,无荚膜。
3、分离培养
本菌生长对营养要求不高。对有正常菌群存在的临床标本或来自环境中的标本应接种选择性培养基如麦康凯琼脂培养基(MAC);对无正常菌群存在的临床标本如血液、脑脊液、穿刺液等可接种普通全营养型培养基(如TSA、PCA、营养琼脂)或血琼脂培养基、铜绿假单胞菌培养基。普通琼脂培养基上生长18~24h可以见到扁平、湿润的菌落,该菌所产生的带荧光的水溶性青脓素与绿脓素相结合将使得培养基呈亮绿色;在血琼脂平板上生长时可以见到在菌落的周围有溶血环,菌落呈金属光泽;在铜绿假单胞菌培养基上呈蓝绿色或者红褐色菌落,365nm紫外灯下显荧光。如果是在液体培养基中则呈浑浊状生长,在液体表面形成菌落,而在培养基底部的细菌生长不良。
4、生长实验
铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长。
四、生化鉴定
分型
(1)噬菌体分型:所应用的噬菌体现有24株,分型率达90%。
(2)血清学分型:利用O抗原进行分型,可分20个血清型。
(3)质粒指纹图分析:此项技术是对同种细菌的不同株进行同源性分析的一种方法。根据细菌携带质粒的情况进行分析。
五、临床意义
铜绿假单胞菌为条件致病菌,是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者,以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。
常引起术后伤口感染,也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。本菌普遍存在,而多在潮湿环境。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染。感染通常发生于医院内,洗涤槽、防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室,是重要的医院内病原菌。
六、临床症状
(一)败血症
铜绿假单胞菌败血症多继发于大面积烧伤、白血病、淋巴瘤、恶性肿瘤、气管切开、静脉导管、心瓣膜置换术及各种严重慢性疾病等的过程中。本菌引起的败血症约占革兰阴性杆菌败血症的第三至第四位,病死率则居首位。其临床过程与其他革兰阴性杆菌败血症相似,除早产儿及幼儿可不发热外,病人可有弛张热或稽留热,常伴休克、成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)或弥散性血管内凝血 (DIC)等。皮肤出现坏疽性深脓疱为其特征性表现,周围环以红斑,皮疹出现后48~72小时,中心呈灰黑色坏疽或有溃疡,小血管内有菌栓,将渗液涂片革兰染色或培养易找到细菌。皮疹可发生于躯体任何部位,但多发于会阴、臀部或腋下,偶见于口腔粘膜,疾病晚期可出现肢端迁徙脓肿。
(二)呼吸道感染
原发性铜绿假单胞菌肺炎少见,常继发于宿主免疫功能受损后,尤其易发于原有肺部慢性病变基础上,如:慢性支气管炎、支气管扩张、气管切开、应用人工呼吸机后,X线表现为两侧散在支气管肺炎伴结节状渗出阴影,极少发生脓胸。
(三)心内膜炎
常发生于原有心脏病基础上,心脏手术、瓣膜置换术后,细菌常接种于伤口缝线上或补缀物上,也可发生在烧伤或有药瘾病人的正常心脏瓣膜上。炎症可发生在各个瓣膜,但以三尖瓣为多见。如果抗生素延迟应用,有赘生物生长及左心瓣膜病变,则预后较严重,药物治愈率低,最好的治疗是及早进行手术切除赘生物和异物。
(四)尿路感染
铜绿假单胞菌是医院内泌尿道交叉感染的常见菌,占院内感染尿路分离菌的第二位,留置导尿管是截瘫病人获得感染的诱因。其他如:神经原膀胱、尿路梗阻,慢性尿路感染长期应用抗菌治疗易致铜绿假单胞菌感染。40%的铜绿假单胞菌败血症的原发病为尿路感染。
(五)中枢神经系统感染
铜绿假单胞菌脑膜炎或脑脓肿常继发于颅脑外伤、头和颈部肿瘤手术后,或耳、乳突、鼻窦感染扩散蔓延,腰穿术或脑室引流后。粒细胞缺乏、严重烧伤则为铜绿假单胞菌败血症过程中迁徙至脑部的危险因素。临床表现与其他细菌性中枢感染相同,但预后较差,病死率在60%以上。
(六)骨关节感染
主要由于败血症的血行迁徙或来源于邻近组织感染病灶,老年人复杂性尿路感染及泌尿生殖系手术或器械操作,可致多发性椎体骨髓炎。近年来报道,注射海洛因者常致颈椎骨髓炎。临床过程无甚特殊,较少疼痛感,预后不良。
(七)眼科
本菌是角膜溃疡或角膜炎的常见病原菌之一,常继发于眼外伤或农村稻谷脱粒时角膜擦伤后。铜绿假单胞菌污染了隐形眼镜及镜片液是本菌感染眼睛的另一种重要方式。感染发展迅速,48小时内可波及全眼,应予紧急处理,否则易造成失明。
(八)耳、乳突及鼻窦感染
游泳后外耳道的pH 环境因水进入而偏碱性,有利于铜绿假单胞菌生长,造成外耳道炎。精尿病伴血管病变者,偶可发生铜绿假单胞菌所致慢性无痛恶性外耳道炎,如果不及时治疗,后果较差。本菌所致的中耳炎及乳突炎常继发于恶性外耳道炎或急性中耳炎,有糖尿病或其他疾病时,铜绿假单胞菌可通过血管鞘而引起颅内感染。
(九)皮肤软组织感染
败血症病人可继发红斑坏疽性皮疹、皮下结节、深部脓肿、蜂窝织炎等皮损。烧伤创面、褥疮、外伤创口及静脉曲张溃疡面上,经常可培养出铜绿假单胞菌。
(十)消化道感染
铜绿假单胞菌可在消化道任何部位产生病变,常见于婴幼儿以及肿瘤化疗致粒细胞低下的免疫缺损者,可引起婴幼儿腹泻及成人盲肠炎或直肠脓肿。消化道铜绿假单胞菌感染亦是败血症的重要入侵门户之一。
七、耐药性
铜绿假单胞菌的耐药机制异常复杂,主要与以下因素有关:
①细菌产生抗菌活性酶,如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。
②细菌改变抗菌药物作用的靶位,如青霉素结合蛋白(PBPs)、DNA旋转酶等结构发生改变,从而逃避抗菌药物的抗菌作用。
③外膜通透性降低。
④生物膜形成。
⑤主动泵出系统等等。
其中主动泵出系统在铜绿假单胞菌多重耐药机制中起着主导作用。
实验证明,治疗铜绿假单胞菌的临床感染,以复合青霉素类、三或四代头孢菌素、三或四代喹诺酮类等药物为好。但临床抗感染的经验证明,单一抗生素对大多数G-杆菌尤其是铜绿假单胞菌的治疗是不理想的,因其很快就会出现耐药株,从而导致治疗失败,故此,NCCLS以及许多权威的专业人士早已主张联合用药。
亚胺培南对此菌的敏感性虽然很高,但由于它易致二重感染,有文献报导其耐药菌和霉菌进驻发生率可高达3.2%和8.0%,同时它又是诱导酶产生的良好诱导剂,加上异常价格昂贵,故此,亚胺培南作为治疗混合感染的二线用药可能会更合理。
由于广谱抗生素、激素以及免疫抑制剂的广泛使用,铜绿假单胞菌对多种抗生素快速产生耐药性在临床抗感染的一线战场己是不争的事实,对NCCLS推荐的一线用药,如庆大霉素、头孢噻甲羧肟、哌拉西林等亦早己产生不同程度的耐药性,这就使得临床的抗感染治疗显得越来越困难。故此,临床上还应加强消毒防御,控制感染发生,同时,应更为合理地科学地使用抗生素,并应在药敏试验结果指导下进行抗感染治疗。
第三代头孢菌素中的头孢他啶是经典的抗铜绿假单胞菌药物,但随着耐药菌株的迅速增加,一些对铜绿假单胞菌活性增强或对耐药菌株有效的第四代头孢菌素(如马斯平)以及第四代喹诺酮(如天坤)均已经陆续涌现,且有相当部分品种已用于临床,这对临床抗感染治疗无疑是个好消息。而今,含儿茶酚取代基的第四代头孢菌素是开发研究的热点,有被称为"第五代"之势。其中GR69153、LB10522、Ro9-1428、Ro09-1227和RU-59863对铜绿假单胞菌的抗菌作用更强且对耐药菌株更有效,体外活性更为出色,远强于头孢他啶。
细菌生物膜(biofilm)在铜绿假单胞菌感染中广泛存在,是导致抗菌治疗失败的重要原因之一。大环内酯类抗生素自身几乎没有抗铜绿假单胞菌的活性,但能抑制生物膜的形成,调节免疫,增强吞噬细胞的吞噬作用,抑制铜绿假单胞菌的一些毒性因子而增强其他抗铜绿假单胞菌药物的活性,改善疗效。研究发现,红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素能有效抑制生物膜形成,短期联合头孢他啶等抗铜绿假单胞菌药物后就可明显改善临床疗效(如克拉霉素5d方案),其中以阿奇霉素抑制作用最强。
总之,为了提高抗菌治疗效果,应经常监测本地区及本单位的病原菌对抗菌药物的敏感性及其耐药特性,并根据药敏试验有针对性地合理地选用抗菌药物,且在临床实践与研究中探讨抗感染的药物组合和开发新的抗感染药物。同时,改善卫生条件,严格执行消毒隔离制度,防止耐药菌的交叉感染,控制医院感染的发生率,也是一项非常重要的工作。
八、预防
积极治疗原发病,缩短住院时间;医院必须严格消毒病房、器械、敷料,医务人员及护理员勤洗手,认真执行无菌操作;对携带多药耐药病菌者进行接触隔离以防引起医院感染。注意个人防护,勤洗手,提高机体免疫力,避免与铜绿假单胞菌感染患者接触,有皮肤创面是应及时消毒处理。
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