TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系的应用与培养操作!
一、背景
TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系是一种来源于小鼠肾小管上皮细胞的细胞系,常用于研究肾脏疾病的发生机制、药物筛选和毒性评价等。该细胞系具有以下特点:
来源:TCMK-1细胞系来源于小鼠肾小管上皮细胞,经过多次传代和筛选,形成了一个相对稳定的细胞系。
形态特征:TCMK-1细胞呈多边形或长条形,大小约为15-30微米,胞质丰富,核大而圆,核仁明显。
生长特性:TCMK-1细胞生长迅速,传代周期约为24-48小时,可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中稳定生长。
特异性标志物:TCMK-1细胞表达多种特异性标志物,如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等,可用于鉴定其肾小管上皮细胞特性。
其他特性:TCMK-1细胞还具有一定的增殖能力,可用作研究肾脏疾病发生机制和药物筛选的模型。
二、TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系培养操作
1)复苏TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系:以下细胞培养冻存处理仅供参考,具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min,弃去上清液,加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10 cm皿中,加入约8 mL培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
a、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,使消化液浸润所有细胞,弃去消化液,将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基,轻轻打匀后装入无菌离心管中,1000 rpm离心4 min,弃去上清液,补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中,置于培养箱中培养。
3)TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例;
a、收集细胞及细胞培养液,装入无菌离心管中,1000 rpm条件下离心4 min,弃去上清液,用PBS清洗一遍,弃尽PBS,进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液,使细胞密度5×106~1×107/mL,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱,24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系可以用于Tisp40在肾间质纤维化中的作用和机制研究:
Tisp40与肾间质纤维化的关系目的:探讨Tisp40在缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)诱导的肾间质纤维化及转化生长因子betal(Transforming growth factor betal,TGF-β1)诱导的TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系中表达量的变化,验证所构建的慢病毒转染Tisp40过表达细胞系TCMK-1/Tisp40效果并在3种所构建的siRNA-Tisp40中筛选沉默效果最好的siRNA-Tisp40。
方法:体内实验C57BL/6小鼠I/R建立肾脏纤维化动物模型,免疫组化、RT-PCR及Western blot检测各组小鼠肾脏Tisp40的分布与表达。体外实验采用TGF-β1(10ng/ml)刺激TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系24h建立肾细胞纤维化模型,Western blot检测TGF-β1不同浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)下Tisp40蛋白的表达变化。在野生型TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系(TCMK-1/wildtype,TCMK-1/wt)及Tisp40过表达的TCMK-1/Tisp40细胞中,RT-PCR及Western blot检测Tisp40 mRNA及蛋白表达变化,免疫荧光评估所构建的TCMK-1/Tisp40细胞效果。Western blot检测Tisp40被沉默后的蛋白表达,比较三种siRNA-Tisp40(siRNAl-Tisp40,siRNA2-Tisp40,siRNA3-Tisp40)沉默效率。
结果:体内实验假手术组小鼠(Sham)肾脏Tisp40表达较少;缺血再灌注纤维化组(I/R)中小鼠肾脏Tisp40mRNA及蛋白表达明显增加(p<0.05),Tisp40蛋白主要表达于肾小管。体外实验Tisp40随TGF-β1浓度(0.1,1,10ng/ml)及刺激时间(4,8,12,24,48h)改变,表达逐渐增多,存在浓度及时间依赖性,在lOng/mlTGF-βi刺激24h后Tisp40表达基本稳定;TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系/wt细胞在TGF-β1刺激前,仅少量表达Tisp40,TCMK-1/wt细胞及TCMK-1/Tisp40细胞经TGF-β1刺激24h后,Tisp40mRNA及蛋白表达明显增多(p<0.05),在TGF-β1刺激前后,TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞系/Tisp40细胞的Tisp40表达均高于TCMK-1/wt细胞(p<0.05),Tisp40过表达细胞系TCMK-1/Tisp40构建成功。3种siRNA-Tisp40均可沉默Tisp40,siRNA3-Tisp40沉默效率最高。
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