RIN-m5F细胞系的知识与应用及培养操作!
一、背景
RIN-m5F是一种来源于大鼠的胰岛β细胞瘤细胞系。这些细胞是通过大剂量放射线照射近交系NEDH大鼠,再经过裸鼠维持肿瘤后得到的。RIN-m5F细胞系具有分泌胰岛素及L型多巴脱羧酶的特性,但不产生生长激素抑制激素。因此,它们常被用于胰岛细胞信号转导和胰岛肿瘤相关的研究。
在研究中,RIN-m5F细胞系常被用作体外模型来模拟胰岛β细胞的功能和行为。例如,它们可以用于研究胰岛素的分泌、合成和代谢等生物学过程,以及胰岛β细胞在糖尿病等疾病中的变化。此外,RIN-m5F细胞系也可以用于药物筛选和毒理学研究,以评估药物对胰岛β细胞的影响和潜在毒性。
然而,需要注意的是,虽然RIN-m5F细胞系具有一定的代表性,但并不能完全模拟真实的人体环境。因此,在将实验结果应用于临床之前,仍需要进行更多的实验验证和临床研究。
此外,有研究表明,金丝桃素的光动力学效应可以显著地抑制RIN-m5F细胞的增殖,这为开发新的抗肿瘤药物提供了思路。同时,RIN-m5F细胞系也被用于软琼脂克隆形成实验,以研究化合物对细胞活力的影响。
二、RIN-m5F细胞系培养操作
1)复苏RIN-m5F细胞系:以下细胞培养冻存处理仅供参考,具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min,弃去上清液,加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10 cm皿中,加入约8 mL培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)RIN-m5F细胞系传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
a、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,使消化液浸润所有细胞,弃去消化液,将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基,轻轻打匀后装入无菌离心管中,1000 rpm离心4 min,弃去上清液,补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中,置于培养箱中培养。
3)RIN-m5F细胞系冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例;
a、收集细胞及细胞培养液,装入无菌离心管中,1000 rpm条件下离心4 min,弃去上清液,用PBS清洗一遍,弃尽PBS,进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液,使细胞密度5×106~1×107/mL,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱,24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
RIN-m5F可以用于γ-氨基丁酸对RIN-m5f细胞的保护作用及机制探究:
研究拟建立高糖(G)和H2O2氧化损伤RIN-m5f细胞模型,以探讨GABA对胰岛β细胞抗氧化调节作用及其作用机制。
方法:分别采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f细胞48h,以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立体外氧化损伤细胞模型。GABA干预实验分为:对照组(11mM G)、损伤组(G/H2O2)、GABA组(G/H2O2+GABA)、硫辛酸组(G/H2O2+LA)。采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平;检测细胞氧化还原状态指标和胰岛素分泌水平;MTT法测定细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡线粒体膜电位;RT-PCR法检测与抗氧化、抗凋亡和胰岛素分泌相关基因mRNA表达水平;Western blot法检测Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β(Ser9)和p-GSK-3β(Tyr216)磷酸化水平。
结果:随着G和H2O2浓度的增加,胞内ROS和MDA水平显著提高(P<0.05),且GAD1mRNA表达水平极显著下调(P<0.01),细胞均出现不同程度的氧化损伤(P<0.05);添加100μM和200μM GABA可显著降低胞内ROS和MDA水平(P<0.05),提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力,上调抗氧化及抗凋亡相关基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表达水平(P<0.05),提高细胞线粒体膜电位和存活率(P<0.05);此外,GABA可显著提高胰岛素合成相关基因(INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2)mRNA表达水平(P<0.05),促进胰岛素分泌释放;Western blot结果显示,GABA显著抑制氧化损伤细胞(44mM G和100μM H2O2)GSK-3β蛋白水平(P<0.05),显著提高p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平和Nrf2核质比例(P<0.05),但对p-GSK-3β(Tyr216)磷酸化水平无显著性影响(P>0.05)。
结论:GABA可显著增强氧化损伤(G和H2O2)RIN-m5f细胞抗氧化能力,提高细胞存活率和胰岛素合成分泌,具有抗凋亡作用;GABA可调节胞内GSK-3β/Nrf2通路相关基因mRNA表达水平,显著提高Nrf2核质比例,增强细胞抗氧化能力,其作用机制可能与提高p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有关;GABA抗氧化调节作用具有浓度依赖效应,即随着氧化损伤程度的增加,GABA需要量增加。
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