NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系的应用研究!
一、背景
NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系于1988年6月建立,来源软组织转移灶。患者接受了早期放射治疗,是一位吸烟者。
二、NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞复苏、传代及冻存流程参考:
1、NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞复苏
1)配制完全培养基:基础培养基+胎牛血清+双抗(特殊培养基特殊配置);
2)细胞复苏:取5ml完全培养基于15ml离心管中,37℃水浴锅预热,从液氮管(或者-80度冰箱)中快速取出冻存的细胞,放入37℃水浴锅中,摇晃使快速化冻(1min左右),然后将化冻的细胞和预热的培养基,移入超净工作台中,化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中,1000rpm离心5min;
3)吸弃上清,得到细胞沉淀,用2ml完全培养基轻轻重悬细胞,加入到T25培养瓶中,做好标记,放入37℃,5%CO2饱和适度培养箱中培养(培养皿复苏效果更好);
4)24h后,观察细胞贴壁情况(未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞),吸弃旧培养基,加入新鲜的预热(室温或37℃)的完全培养基,继续培养。
2、NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代
1)待细胞生长到80%-90%汇合度时,吸弃旧的培养基,加入1ml无菌PBS润洗一次,以去除残余的培养基及血清(血清含有胰酶的抑制因子),然后加入1ml 0.25%胰酶,37℃培养箱中消化(1~2min左右,不同细胞消化时间不同),取出细胞,镜下观察细胞至细胞皱缩变圆;
2)加入1ml完全培养基(含FBS)终止消化,轻轻拍打,使细胞脱落下来成单个细胞悬液,收集细胞于15ml无菌离心管中,1000rpm,离心5min;
3)收集细胞沉淀,完全培养基重悬,一分为二(可根据细胞生长速度调整比例),分别加入到2个新的培养瓶中,做好标记,放入培养箱中培养。
3、NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存
1)按照细胞传代方法,在超净工作台内消化收集细胞沉淀,取少量细胞用于计数;
2)用预冷的1ml冻存液(90%完全培养基+10%DMSO)或者无血清细胞冻存液重悬细胞,加入到1.2ml冻存管中,密度为1*106个/ml。
3)放入程序冻存盒,-80℃过夜后,转入液氮长期保存。
三、应用
NCI-H1944人非小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于mTOR激酶抑制剂PQR620抗非小细胞肺癌的机制研究:
在非小细胞肺癌(NSCLC)中,哺乳动物雷帕霉素靶标(m TOR)异常激活促进了肿瘤的发生发展。PQR620是一种新型高效的m TOR激酶抑制剂。
在这里测试了它在NSCLC细胞中的潜在活性。在原代人类NSCLC细胞和已建立的细胞系(A549和NCI-H1944)中,PQR620抑制细胞生长、增殖和细胞周期进程,以及细胞迁移和侵袭,同时显著诱导细胞凋亡。PQR620破坏了m TOR复合物1(m TOR-Raptor)和m TOR复合物2(m TOR-Rictor-Sin1)的组装,并阻断了NSCLC细胞中的Akt、S6K1和S6磷酸化。过表达持续性激活的Akt1(S473D)激活Akt-m TOR信号通路仅部分抑制PQR620诱导的NSCLC细胞的细胞毒性。
PQR620在Akt1/2沉默的NSCLC细胞中仍然具有细胞毒性,这表明PQR620并不完全依赖Akt-m TOR信号发挥抑制NSCLC进展的功能。
事实上,PQR620在原发性NSCLC细胞中诱导鞘氨醇激酶1(Sph K1)抑制、神经酰胺产生和氧化应激。体内研究表明,每天口服单剂PQR620可有效抑制严重联合免疫缺陷小鼠的原发性NSCLC异种移植物生长。在PQR620处理的裸鼠移植瘤中,检测到Akt-m TOR失活、凋亡诱导、Sph K1抑制和氧化应激。
总之,PQR620通过m TOR依赖性和非依赖性机制发挥有效的抗NSCLC细胞活性。
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