HEK293人胚肾细胞系的作用与应用及相关研究!
一、背景
HEK293人胚肾细胞系也被称为人胚胎肾细胞293(Human Embryonic Kidney 293),它是一种永生化细胞系,衍生自人胚胎肾脏。这些细胞具有转染效率高,易于培养等特点。HEK293细胞系是由荷兰生物学家Alex van der Eb在1973年从人类肾脏细胞中首次分离出来的。这些细胞是在女性胎儿的组织培养物中生长的。后来,Van der Eb实验室的博士后研究员Frank Graham对这些细胞进行了剪切的人类腺病毒5型DNA转染,使其能够非常有效地产生大量重组蛋白。因此,该细胞系被命名为HEK293,以纪念这次实验是Frank Graham的第293次实验。
二、HEK293人胚肾细胞系细胞培养操作
1)复苏HEK293人胚肾细胞系细胞:以下细胞培养冻存处理仅供参考,具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min,弃去上清液,加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10 cm皿中,加入约8 mL培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)HEK293人胚肾细胞系细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
a、弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,使消化液浸润所有细胞,弃去消化液,将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基,轻轻打匀后装入无菌离心管中,1000 rpm离心4 min,弃去上清液,补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中,置于培养箱中培养。
3)HEK293人胚肾细胞系细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为例;
a、收集细胞及细胞培养液,装入无菌离心管中,1000 rpm条件下离心4 min,弃去上清液,用PBS清洗一遍,弃尽PBS,进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液,使细胞密度5×106~1×107/mL,轻轻混匀,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱,24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
三、应用
HEK293人胚肾细胞系可以用于氧化应激在氢醌致人胚肾细胞HEK293 DNA损伤中的作用:
氢醌(1,4-dihydroxybenzene,HQ)是一种重要的工业化学品,可作为摄影工业的显影剂,橡胶工业的抗氧化剂,食品的抗氧化剂生产中间体,并作为聚合乙烯和丙烯酸为单体抑制剂。日常生活中通过某些药物、化妆品也可长时间接触。HQ是苯的代谢物,在苯毒性效应中发挥着重要作用。HQ主要在肝内代谢,经尿排出而解毒;部分富集于骨髓组织,进一步代谢生成对苯醌和对苯半醌。人群流行病调查及实验动物研究均发现长期接触HQ可对肝、肾、骨髓造血造成损伤。1999年,国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)就将HQ归为第三类致癌物,即现有证据尚不能就其对人类致癌性进行分类。体外实验表明,HQ可引起染色体突变。
研究选用HEK293细胞作为试验系统,探讨HQ的DNA损伤作用及可能机制,旨在为评估HQ对人类健康的危害提供有价值的实验室依据。
方法:试验系统为HEK293人胚肾细胞系。通过改良的单细胞凝胶电泳(SCGE)试验检测细胞DNA损伤情况。通过罗丹明123(Rh123)和吖啶橙(AO)分别测定细胞内线粒体膜电位和溶酶体膜稳定性;通过2’,7’—二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)和苯二醛(OPT)分别测定细胞内活性氧(ROS)及还原型谷胱甘肽(GSH)水平。用免疫组化方法测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)在细胞内的表达水平。为探讨其可能的氧化性机制,采用DL—甲硫氨酸磺酰亚胺(BSO)和抗氧化物质羟基酪醇(HT)干预法测定细胞内ROS水平及线粒体膜电位对HQ所致DNA损伤效应的影响。
结果:HQ(3.125,6.25,12.5μM)作用于细胞后,DNA的迁移距离明显增加,且呈剂量依赖关系;作用于HEK293细胞可引起细胞内溶酶体膜稳定性的破坏和线粒体膜电位的下降,也可使细胞内ROS表达水平的明显增加及GSH的耗竭;明显增加HEK293人胚肾细胞系内8-OHdG水平。HT能够拮抗HQ引起的DNA链断裂的形成;BSO能够加剧HQ引起的DNA链断裂的损伤。
结论:HQ可致HEK293人胚肾细胞系DNA损伤,其作用机制可能是通过线粒体膜电位的下降,溶酶体膜破坏,细胞内ROS产生增高及GSH的耗竭,进而导致氧化性DNA损伤。
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