嗜水气单胞菌分离株的鉴定与菌株肠毒素及致病性研究!
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,以下简称Ah)广泛分布于污水、池水及河底土壤中,为革兰阴性杆菌,是引起腹泻的新病原菌。关于此菌的感染, 国外有较多报道, 而国内仅见有零星报道。近年来,我们对云南边防部队感染性腹泻进行病原监测,采集腹泻患者粪便标本328份,在分离多种肠道病原菌的同时,从中分离出5株Ah,该菌经镜检、培养、法国梅里埃VITEK32微生物全自动分析仪系统鉴定及电子显微镜下观察予以证实,并对菌株进行了肠毒素及致病性研究,报道如下。
一、材料和方法
1、菌株来源
从云南边防部队感染性腹泻患者粪便标本中分离。
2、分离培养
将腹泻患者粪便标本接种于SS琼脂平板上置37℃孵箱培养18~24h,挑取可疑菌落进行纯培养。
3、生化鉴定
采用常规法和法国梅里埃VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡进行系统鉴定。
4、电子显微镜检查
将分离菌接种普通肉汤培养基,37℃培养18h, 2%磷钨酸(PH6.4)负染制样,用日立-2型电镜检查。
5、侵袭性测定
采用豚鼠角膜试验(Sereny test)。
6、肠毒素测定
采用乳鼠灌胃法测定热稳定性肠毒素(ST)。
7、致病力测定
15~18g健康小白鼠(购自昆明医学院实验动物中心)雌雄兼用,随机分成试验组和对照组,每组5只,试验组注射Ah肉汤培养物,每只0.5ml,观察小白鼠发病情况,对照组同法注射无菌肉汤,观察7d。
8、药敏试验
采用K-B纸片扩散法。药敏纸片系北京天坛生物技术开发公司产品,在有效期内使用。
二、结果
1、生物学特性
在SS琼脂平板上经37℃培养24h,其菌落形态为圆形,半透明、边缘整齐、光滑、湿润、微隆、直径1~2mm。菌体形态为革兰阴性杆菌,两端钝圆呈单或呈双排列。在暗视野下观察运动极为活泼,在电子显微镜下可见极端鞭毛(见图1)。
2、系统生化鉴定
VITEK32全自动微生物分析仪NFC卡系统鉴定结果见表1。表1 分离的嗜水气单胞菌生化特征试验项目结果
3、侵袭力测定
豚鼠角膜试验阴性。
4、肠毒素测定
经乳鼠灌胃试验测试,分离的5株Ah肠/体之比均大于0.083,分别是0.091、0.105、0.087、0.123、0.096。证明产生较强的热稳定性肠毒素(ST)。
5、致病力测定
5株分离菌肉汤培养物分别腹腔注射小白鼠后,均在24h左右发病,表现为弓背、耸毛、运动迟缓、食欲不振,双眼半闭、呼吸急促等症状,72h内相继死亡。解剖死亡的小白鼠,发现肠水肿,肠腔积液等,取肠内容物培养,仍获原感染菌。注射无菌肉汤的对照组观察7d无不良反应。
6、药敏试验
在所试的12种抗菌药物中 ,对9种敏感,1种中度敏感,3种耐药,见表2。表2 分离的嗜水气单胞菌药敏试验结果抗菌素纸片含量(略)注:S: 敏感; MS: 中度敏感; R:耐药。
三、讨论
1、Ah是气单胞菌属中的细菌之一,该菌广泛存在于水环境中,是一种人—畜—水生动物共患病病原菌。此类菌致病性决定于某些菌株的侵袭力、热稳定性肠毒素和不稳定性肠毒素,该毒素和溶血素为气单胞菌类主要致病因子。该分离菌侵袭力测定为阴性,产热稳定性肠毒素(ST),致病性测定有较强的致病力,与临床症状密切相关。我们从边防部队腹泻病人粪便标本中分离出5株Ah,患者的主要临床表现是:类似急性胃肠炎,症见腹泻、呕吐、腹痛,无发热。Ah不仅感染动物,而且也是引起人类腹泻的新病原菌。由于条件所限,未做不稳定肠毒素和溶血素测试。目前,国外已将Ah纳入腹泻病原菌的检测范围。
2、气单胞菌属的细菌通常不产生赖氨酸脱羧酶,但与致病性有关的气单胞菌赖氨酸脱羧酶阳性率较高,如本次分离的5株Ah赖氨酸脱羧酶均为阳性。对Ah的研究,国内很少有人用电子显微镜观察其菌体形态,我们使用了较先进的电镜对分离的Ah进行观察,有助于对菌体结构的认识。使用先进的VITEK32全自动微生物分析仪对其菌株进行鉴定,具有快速、省事、省力且结果准确等优点。由于Ah的生化特性与肠干菌科、弧菌属、邻单胞菌属较为相似,没有先进设备的基层单位,可利用氧化酶试验、粘丝试验、鸟氨酸脱羧酶和甘露醇、肌醇发酵等反应来鉴别。腹泻病原感染因子的研究在临床治疗上具有重要意义,不同细菌的感染因子所需的首选药物不尽相同,我们做的药敏试验,筛选出敏感、中度敏感、耐药三类药敏谱,对指导部队和地方今后治疗Ah的感染具有重要的指导意义。
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