溶血性链球菌检验的主要内容与适用范围及操作步骤!
1、主题内容与适用范围
本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。
本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球的检验。
2、引用标准
GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂
3、设备和材料
3.1 温箱:36±1℃。
3.2 水浴:36±1℃。
3.3 显微镜。
3.4 离心机。
3.5 试管架。
3.6 灭菌平皿。
3.7 灭菌小试管。
3.8 载玻片。
3.9 灭菌吸管:1 mL、10 mL。
3.10 灭菌镊子。
3.11 均质器。
3.12 酒精灯。
3.13 接种环。
4、培养基和试剂
4.1 葡萄糖肉浸液肉汤:按GB 4789.28 中 4.1 规定,在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。
4.2 肉浸液肉汤:按 GB 4789.28 中 4.1 规定。
4.3 匹克氏肉汤:按 GB 4789.28 中 4.62 规定。
4.4 血琼脂平板:按 GB 4789.28 中 4.6 规定。
4.5 人血浆。
4.6 0.25%氯化钙。
4.7 灭菌生理盐水。
4.8 杆菌肽药敏纸片(含 0.04 单位)。
5、检验程序
6、操作步骤
6.1 样品处理
称取 25 g 固体检样;称取 25 mL 液体检样,加入 225 mL 灭菌生理盐水,研成匀浆制成混悬液。
6.2 一般培养
将上述混悬液吸取 5 mL,接种于 50 mL 葡萄糖肉浸液肉汤;或直接划线接种于血平板,如检样污染严重,可同时按上述量接种匹克氏肉汤,经 36±1℃培养 24 h,挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落,在血平板上分纯,然后观察溶血情况及革兰氏染色,并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。
6.3 形态与染色
本菌呈球形或卵圆形,直径0.5~1 µm,链状排列,链长短不一,短者4~8个细胞组成,长者 20~30 个,链的长短常与细菌的种类及生长环境有关;液体培养中易呈长链;在固体培养基中常呈短链,不形成芽孢,无鞭毛,不能运动。
6.4 培养特性
该菌营养要求较高,在普通培养基上生长不良,在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色,半透明或不透明,表面光滑,有乳光,直径约0.5~0.75 mm,为圆形突起的细小菌落,乙型溶血链球菌周围有 2~4 mm 界限分明、无色透明的溶血圈。
6.5 链激酶试验
致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶) ,此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原,使成血浆蛋白酶,而后溶解纤维蛋白。 吸取草酸钾血浆 0.2 mL,加0.8 mL 灭菌生理盐水,混匀,再加入 18~24 h36±1℃培养的链球菌培养物 0.5 mL 及 0.25%氯化钙 0.25 mL(如氯化钙已潮解,可适当加大至 0.3%~0.35%) ,振荡摇匀,置于 36±1℃水浴中 10 min,血浆混合物自行凝固(凝固程序至试管倒置,内容物不流动) 。然后观察凝块重新完全溶解的时间,完全溶解为阳性,如 24 h 后不溶解即为阴性。
草酸钾人血浆配制:草酸钾0.01 g 放入灭菌小试管中,再加入5 mL人血,混匀,经离心沉淀,吸取上清液即为草酸钾人血浆。
6.6 杆菌肽敏感试验
挑取乙型溶血性链球菌液, 涂布于血平板上, 用灭菌镊子夹取每片含有 0.04单位的杆菌肽纸片,放于上述平板上,于 36±1℃培养 18~24 h,如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。
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