IEC-6大鼠小肠隐窝上皮细胞的培养技巧有哪些?
一、细胞来源描述
大鼠小肠隐窝上皮细胞主要来源于小肠的上皮组织。小肠是消化道的一部分,由十二指肠、空肠和回肠组成。其中,小肠的上皮组织由多种细胞类型组成,包括隐窝上皮细胞、吸收细胞、杯状细胞等。
隐窝上皮细胞是小肠上皮中最常见的细胞类型之一。它们位于小肠黏膜的隐窝区域,形成了许多腺体样的结构,被称为小肠隐窝。隐窝上皮细胞具有分泌黏液和素有保护作用的功能。
注:该细胞表达肠上皮特有抗原。氢化可的松可抑制该细胞的生长。(该细胞体外倍增次数有限,请使用靠前批次于实验)
以下是详细的IEC-6细胞培养技巧,包括操作步骤、培养条件、细胞复苏、传代和冻存等操作步骤:
二、IEC-6细胞的培养基配制
培养基可以使用DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)或RPMI-1640培养基,添加10%胎牛血清(FBS)。
在培养基中加入10ug/ml胰岛素,胰岛素是无血清哺乳动物细胞培养基中的普遍添加物质,在许多细胞活动中发挥重要作用:如促进糖和氨基酸转运,提高合成代谢降低分解代谢,刺激细胞生长等等。
DMEM +10%胎牛血清+1%P/S+10ug/ml胰岛素
注意:
①低温保存的细胞非常脆弱,请将冻存管放入37C的水中解冻,尽快复苏细胞。
②提前室温预热培养基。
1、在无菌区准备好 15ml 离心管和 T-25 培养瓶并分别加入 5ml 完全培养基;
2、将冻存管放入 37C水浴锅中,握住冻存管不停晃动,直到内容物完全融化。然后立即将冻存管从水浴中取出,擦干并喷洒 75%乙醇,移至无菌区;
3、小心地拆卸盖子,不要碰到里面的螺纹,用移液枪轻轻吸出细胞悬液,加入到准备好的15ml 离心管中,1000rpm 离心 5min;
4、弃上清后,轻弹离心管底部分散细胞沉淀,加入适量完全培养基重悬细胞后转入准备好的 T25 培养瓶 (建议加液量: 5~7ml) ;
5、轻轻摇动培养瓶使细胞均匀分布,如有必要(如使用不透气瓶),松开阀盖,以便气体交换
6、将培养瓶放入 CO 培养箱中培养
三、细胞培养条件
在37°C的恒温培养箱中培养细胞。
维持细胞的湿度和合适的CO2浓度(通常为5%)。
四、细胞传代
1、细胞未长至 85%时,用 75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到生物操作台内,严格无菌操作,打开细胞培养瓶,若培养瓶上无特殊标注,吸去剩余培养液,只留 6-8ml 培养液继续培养。
细胞已长满达 85-95%。即可进行传代,具体步骤如下:
(1)弃去培养液,用 PBS 洗涤 1-2 次;
(2)加入 1.0m 胰酶消化液,37C 消化约 10min(消化时间根据不同细胞及所用胰酶有所差异),显微镜下观察细胞消化情况,若细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落,则迅速拿回操作台,加入至少双倍的含 10%血清的完全培养液,终止消化并轻轻吹打细胞.使其变成单细胞悬液;
(3)将细胞收集于离心管中离心 1000rmp/5min,弃上清,轻弹管底,将细胞弹散:加入新鲜培养基重悬细胞,进行传代;如果没有特别说明,建议收到细胞后的第一次传代比例为 1:2。
注:①观察细胞密度最好用(4X 物)观察,以确的断胞密度,观察细胞形态请用(10X 或20X)高倍镜观察。②推荐使用 0.25%胰酶EDTA 消化液。③瓶中运输的培养液不能重复使用,请换新鲜培养液培养。④有些细胞贴壁不牢,如发现贴壁细胞有脱落,可离心重后接种到新瓶内。
五、细胞冻存
当细胞达到合适的传代次数时,可以进行冻存以备将来使用。
使用合适的冻存培养基,含有10%二甲基亚砜(DMSO)和10%胎牛血清。
缓慢添加冻存培养基到细胞培养皿中,使细胞逐渐适应冻存液的浓度。
将细胞悬浮液分装到冻存管中,并在-80°C或液氮罐中冷冻保存。
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