食线虫真菌少孢节丛孢的作用与培养及应用研究！

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少孢节丛孢，壳霉目壳霉科真菌，拉丁纲名是Fungi Imperficti，中文纲名是半知菌纲，主要用途是食线虫真菌。

菌种简介

平台编号：Bio-13037

规格：斜面培养物

拉丁属名：Arthrobotrys Oligospora

中文译名：少孢节丛孢

拉丁学名：Arthrobotrys oligospora

原始编号：920

菌株来源：←中国科学院微生物研究所

保藏人：刘杏忠

直接来源国家：中国

保藏时间：11/1/2004

生物危害：四类

模式菌株：非模式菌株

菌株用途：食线虫真菌

培养温度：25℃

培养基：0014    

分离源：烟地土壤

采集地点：云南省江川渔村

采集国家：中国

提供形式：斜面培养物

用途：食线虫真菌

注意事项：仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用，非食用（产品信息以出库为准）

小RNA和RNAi机制在少孢节丛孢生活方式转化过程中发挥作用

（神秘的地球uux.cn报道）据EurekAlert：在生物界中，真菌作为真核生物，自成一门。真菌能够引起植物多种病害，给农林业生产造成巨大的经济损失。真菌还可引起动物和人类的多种疾病。真菌引起的病害难以防治，其中一个重要原因在于真菌感染的机制尚不明确；同时，真菌和感染的宿主同为真核生物，为防治增加了难度。真菌通常营多种生活方式，以此适应各种各样的生存环境。真菌从营腐生生活方式向寄生生活方式的转变，与病原真菌的感染性密切相关。最近有研究发现，在少孢节丛孢转向肉食性生活方式的过程之中，小RNA及其相关调控发挥了重要作用，为揭示真菌生活方式转化的分子机理研究提供了新的视点。

该研究由省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室张克勤课题组完成，在线发表于《中国科学：生命科学》英文版，题目为“The lifestyle transition of Arthrobotrys oligospora is mediated by microRNA-like RNAs”。

少孢节丛孢是一种典型的捕食线虫真菌。在土壤环境中，少孢节丛孢通常营腐生生活方式。在遭受到线虫诱导的情况下，少孢节丛孢会生成特异化的捕食器官，即三维粘性菌网，捕捉线虫，并随后穿刺线虫体壁，将其消化吸收。捕食器官的形成，是少孢节丛孢转向肉食性生活方式的显著标志。线虫，特别是植物寄生性线虫，在农林业生产中会造成巨大的经济损失，已经成为最严重的农业病害之一。在自然界中，以少孢节丛孢为代表的捕食线虫真菌，正是线虫的天敌之一，为线虫的自然防控发挥了重要作用。因此，对于少孢节丛孢的“变身”机制研究，具有非常重要的科学意义和生产价值。

该研究团队利用小RNA测序和Northern杂交技术从少孢节丛孢诱导产生捕食器官过程中筛选并验证了7个小RNA。其中，两个小RNA的敲除会对少孢节丛孢的生活方式转化产生显著的抑制效应。RIP分析表明，其中两个小RNA是与QDE-2蛋白（即Ago蛋白）结合在一起发挥作用的。在这些小RNA的潜在靶标基因中，有三个也是与QDE-2蛋白结合在一起的。有趣的是，这些靶标基因包括了qde-2本身，而烟草表达系统中的体外实验，进一步验证了qde-2基因本身可能是被小RNA所调控。敲除qde-2基因，会对少孢节丛孢的生活方式转化会产生更为深远的影响，对不同诱导物的反应都被显著地抑制了。研究表明，小RNA和RNAi机制，在少孢节丛孢诱导生活方式转化过程中发挥重要作用。

小RNA在动物和植物中广泛存在，发挥着非常重要的调控作用，但是在真菌中却鲜有报道。少孢节丛孢生活方式转化过程中的小RNA研究，进一步确认了小RNA在真菌中的存在，为真菌“变身”机制研究提供了新的思路。

该研究得到国家基础研究计划（2013CB127500）、国家自然科学基金 （31160021，31270131，U1502262）、省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室开放课题 （2018KF003）和南京邮电大学科研基金（NY218140）的资助。

微生物培养方法

1、孢子制备

⑴放线菌孢子的制备

一般采用琼脂斜面培养基,培养基中含有一些适合产孢子的营养成分,如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1%,氮源不超过0.5%),碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境,不利于放线菌孢子的形成,氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下,干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃,少数为37 ℃,培养时间为5~14天。

⑵产品仅限用于科研霉菌孢子的制备

霉菌的孢子培养,一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖,而且这类培养基的表面积较大,可获得大量的孢子。霉菌的培养一般为25~28 ℃,培养时间为4~14天。

2、种子制备

⑴摇瓶种子制备

摇瓶种子进罐,常采用母瓶、子瓶两级培养,有时母瓶种子也可以直接进罐。种子培养基要求比较丰富和完全,并易被菌体分解利用,氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓,子瓶培养基浓度比母瓶略高,更接近种子罐的培养基配方。

⑵种子罐种子制备

种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子,把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子,将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。

保藏方法

1、传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。

2、液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3、载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4、寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5、冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20-30℃，-50-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6、冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

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