供货周期: | 现货 |
品牌: | 百欧博伟生物 |
规格: | |
货号: | bio-54259 |
CAS号: |
仓鼠肾成纤维细胞的培养操作与应用!
一、细胞简介
平台编号:bio-54259
拉丁属名:BHK-21 [C-13]
细胞名称:BHK-21 [C-13]仓鼠肾成纤维细胞
描述;1961年3月,I.A. Macpherson和M.G.P. Stoker从1日龄的仓鼠建立了BHK-21 (C-13)的亲本。随后84天连续培养,仅中断8天进行冻存,通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主,用于表达包含选择及扩增标记的DNA(如Factor VIII,见ATCC CRL-8544)的载体。
动物种别;仓鼠
组织来源:正常肾
形态:成纤维细胞
培养基和添加剂:MEM培养基(GIBCO,货号41500034,添加NaHCO3 1.5g/L,Sodium Pyruvate 0.11g/L),90%;优质胎牛血清,10%。 气相:空气,95%;二氧化碳,5%。温度:37摄氏度。
供应限制:仅供研究之用。
注意事项:仅用于科学研究或者工业应用等非医疗目的,不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用
二、背景
BHK-21[C-13](仓鼠肾成纤维细胞)是I.A.Macpherson和M.G.P.Stoker从1日龄的仓鼠建立了BHK-21(C-13)的亲本。随后84天连续培养,仅中断8天进行冻存,通过单细胞分离建立了13号克隆。这株细胞可用作转染宿主,用于表达包含选择及扩增标记的DNA(如Factor VIII,见ATCC CRL-8544)的载体。
三、BHK-21[C-13](仓鼠肾成纤维细胞)细胞培养操作
1、复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2、细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
(1)弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
(2)加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
(3)按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
(4)将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;
(1)细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
(2)4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。
(3)将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
四、应用
用于工频磁场对中国仓鼠肺成纤维细胞自噬的诱导作用研究:
早期的研究表明极低频磁场可以诱导细胞分子水平的改变,如:细胞缝隙连接功能(GJIC)下降、细胞膜表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)聚簇,以及基因和蛋白质表达谱发生改变等等。细胞自噬是机体重要的一种防御和保护机制,它大量降解并重复利用长寿命蛋白质、大分子物质以及细胞内受损的细胞器等,使细胞能够在饥饿环境下得以生存,细胞自噬和神经退行性疾病、衰老以及肿瘤相关。
方法:CHL细胞培养24小时,更换新鲜的培养基后进行50Hz0.4mT工频磁场暴露30分钟、2小时、6小时、12小时或者24小时,磁场暴露后通过以下三种方法检测细胞自噬水平:透射电镜观察细胞内空泡变化,激光共聚焦显微镜检测细胞内GFP-LC3定位自噬小体情况以及Western Blot实验检测细胞内LC3-Ⅱ表达。结果:透射电子显微镜观察到,工频磁场暴露30分钟和24小时诱导细胞内空泡增加;激光共聚焦显微镜观察到,在GFP-LC3高表达的CHL细胞内,工频磁场暴露不同时间点诱导GFP-LC3亮点标记的自噬小体增加(P>0.05),30分钟和24小时升高趋势较为明显;
Western Blot技术检测发现磁场暴露促进自噬的特异性标记蛋白LC3-Ⅱ表达增加(P>0.05),30分钟和24小时升高趋势较为明显;加入自噬小体与溶酶体融合的阻断剂氯喹后,磁场暴露30 min自噬流量增加(P<0.05)。结论:这些研究提示本实验条件下50Hz0.4mT工频磁场暴露可能诱导CHL细胞自噬效应。
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