捷报：IPHASE成功研发转运体OATP1B1/3、OAT1/3、OCT2、MATE1、MATE2-

汇智和源生物技术（苏州）有限公司

2024/10/25 14:41

近年来，人们越来越认识到，除了药物代谢酶以外，药物转运体在许多药物的吸收、分布和排泄中发挥着重要的作用。由于多态性或药物-药物相互作用（DDI）导致的转运蛋白功能丧失已被证明会导致药物处置、疗效甚至毒性发生显著变化，进一步强调了药物转运体研究的重要性，监管机构也期望新药申请需进行转运体的体外研究，以评估转运蛋白介导的DDI的潜在风险。

转运体介绍

转运体（transporter）是一类表达于细胞膜的功能蛋白，在人体全身组织中均有表达，通过影响药物的吸收、分布和消除而影响药物的药代动力学和药效学特征。介导药物进入细胞的转运体可将药物摄取进入组织器官，从而提升药物生物利用度以及改变药物的组织分布，属于可溶性载体（Solute carrier，SLC）转运体；介导药物外排的转运体可利用水解ATP的能量将某些药物排出细胞，从而降低细胞内药物浓度，产生耐药性，属于ATP结合盒（ATP binding cassette，ABC）转运体。

可溶性载体超家族是人类细胞膜上最重要的膜转运体家族之一，它参与了细胞间的物质运输、能量传递、营养代谢、信号传导等重要生理活动。SLC超家族包括 52个亚家族，共有 400多名成员。临床应用中与DDI有关的溶质转运体大多是摄取型转运体，包括有机阳离子转运体（organic cation transporter, OCT)2；有机阴离子转运体（organic anion transporter, OAT) 1/3；有机阴离子转运多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP) 1B1/1B3；寡肤转运体（oligopeptide transporter, PEPT)1 等。其中，多药及毒性化合物外排转运体（multidrug and toxin extrusion proteins, MATE) 1/2-K 是SLC转运体，但属于外排型转运体。

ATP结合盒（ATP Binding Cassette，ABC）转运体是最大的转运体超家族，分为ABCA~G共7个亚家族，属于主动运输转运体，依赖于ATP发挥转运活性，以逆浓度梯度形式将药物排出体外。参与药物转运的ABC转运体主要包括P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多药耐药相关蛋白(multidrug resistance protein，MRP)等。

图1 药物转运蛋白在人体各组织器官中的分布

各国指导原则对转运体研究的要求

药物转运体是决定细胞内药物积累的关键因素，其活性往往与药物的治疗效果、毒性及药物-药物相互用 (Drug-drug interaction，DDI) 直接相关。美国、欧洲和中国的药品监管部门也相继出台指导原则，建议体外评估主要转运体与受试药物之间潜在的相互作用，为体内研究提供参考。

表1 各国指导原则对转运体研究的建议

“√”必须考虑；“×”不考虑

转运体研究体外模型

在开始转运体研究之前，一个重要的考虑就是选择合适的体外试验系统。目前，指导原则推荐的体外评估由转运体引起的DDI模型主要包括膜囊泡系统、基于极化细胞的双向转运系统及单向摄入的细胞系统等。

3.1 膜囊泡系统

转染转运体蛋白的细胞的外翻膜囊泡系统是评价在研药物是否为ABC转运体（如P-gp、BCRP、BSEP等）的底物或抑制剂的常用模型。通常，膜囊泡可通过感染昆虫细胞（如Sf9或Sf21），或转染哺乳动物细胞（如HEK293、HeLa、V79或MDCK）等进行制备。囊泡外翻后，原本表达在胞内的转运体将被外翻至囊泡外，与药物共孵育时，药物直接作用于外翻转膜上的转运蛋白，转运蛋白可以将药物转运到囊泡内，可检测药物的吸收而非外排，即测定囊泡内药物含量即可反应转运体对药物的作用。

图2 膜囊泡系统的研究方案

3.2 基于极化细胞的双向转运系统

基于极化细胞的双向转运系统是指能够自发极化形成完整细胞单层的细胞系，如Caco-2、MDCK、LLC-PK1等。将细胞接种在Transwell小室上，培养至形成完整的极化细胞单层，将受试药物添加到单层细胞的顶端（apical，AP）或基底侧（basolateral，BL），测量渗透入接收室中的药量，根据AP→BL（吸收）和BL→AP（流出）两个方向上的表观渗透系数（apparent permeability coefficient，Papp）计算外排率（efflux ratio，ER），评价化合物是否为该ABC转运体底物。此外，通过测量探针底物在BL→AP方向的净流量或ER值的变化，也可以进行化合物对特定转运体抑制作用的评估。

3.3 单向摄入的细胞系统

将重组转运体基因稳定或瞬时转染到不同的细胞系，可用于评价在研药物是否为SLC转运体（如OCTs、OATs、OATPs和MATEs）的底物或抑制剂。由于HEK293和CHO细胞具有低内源性转运蛋白活性并且易于维持的特点，常用于表达摄取转运蛋白。当评价药物是否为转运体的底物时，应将转染细胞中的药物摄取与亲代或空载体转染细胞系进行比较，且应比较有或无转运体抑制剂时的药物摄取。当评估药物是否为转运体的抑制剂时，仅使用转运体转染的细胞系评价已知探针底物的摄取便已足够。

3.4三明治培养肝细胞

肝细胞中除了含有丰富的药物代谢酶，还表达多种重要的转运体。三明治培养是将肝细胞培养于两层胶原之间，底层为鼠尾胶使肝细胞贴壁，上层为Matrigen胶使其形成肝板样结构。培养几天后，肝细胞形成完整胆小管网络并同时保持紧密连接，且肝脏转运体正常表达并定位于恰当的膜区域，可用于转运体功能研究。

试验系统——膜囊泡

应用

•评估药物与外排转运蛋白（ABC转运蛋白）的相互作用

•确定底物特异性和确定抑制剂

优势

•适用于低通透性的化合物

•细胞毒性化合物不会影响实验系统

•重组系统中的高转运蛋白表达水平，转运蛋白表达可以在某些表达系统中“滴定”

•可以制备大量并冷冻保存以备随时可用

•能够预加载各种缓冲液和物质

•准确测定动力学，因为孵育缓冲液中的底物可以直接进入活性位点

局限性

•不适合具有高渗透性或高非特异性结合的化合物

•昆虫细胞中的低糖基化可能改变运输特性

•表达系统中的内源性运输活性可能使数据解释复杂化•转运蛋白活性因批次而异

•如果在室内制备（超离心或氮空化弹），则需要特殊设备

试验系统——单向摄入的细胞系统

应用

•评估药物与摄取转运蛋白（OATPs,OCTs, OATs，NTCP）的相互作用

•确定底物特异性并确定抑制剂

优势

•允许调查单个转运蛋白的特性

•稳定转染的细胞系可以传代多次使用或冷冻保存

•低复杂性

局限性

•宿主细胞内源性转运蛋白活性可能使数据解释复杂化

•稳定重组细胞系的产生和表征是耗时的（>1个月）

•转运蛋白表达水平在实验室之间有所不同

试验系统——基于极化细胞的双向转运系统

应用

•评估外排转运体的药物转运

•确定底物特异性并确定抑制剂

•定性地研究摄取和外排转运体之间的相互作用

优势

•运输受非特异性结合的影响较小，因为只有穿过细胞单层的化合物才被测量

•适合评估主动运输与扩散

局限性

•内源性转运蛋白活性可能使数据解释复杂化

•需要评估质量平衡

•复杂的动力学研究

•除非摄取转运蛋白共表达，否则不适合低通透性的化合物

试验系统——肝细胞三明治模型

应用

•评估肝脏摄取/外排和胆道排泄

•识别涉及肝胆药物处置的转运蛋白和限速步骤

•评估由于转运蛋白抑制而引起的药物性胆汁淤积的可能性

•调查摄取和外排转运蛋白之间的相互作用

•评估药物的细胞内浓度、Kpuu和亚细胞分布

优势

•系统模拟胆汁排泄，可以测量胆道清除率

•表达摄取和外排转运蛋白、代谢酶和调节机制的整体系统

•可以使用从感兴趣的物种中冷冻保存或新鲜分离的肝细胞

•适用于识别转运蛋白抑制剂（竞争性和非竞争性）和诱导剂

•在临床前物种和人类中证明了体外对体内的相关性

局限性

•需要一定的培养时间才能在合适的膜域中正确定位转运蛋白

•不太适合低清除率的化合物（特别是如果涉及代谢）

•酶/转运蛋白的表达/活性可能会受到培养条件的调节

转运体研究的关键点把控

4.1 ABC转运体研究的关键点

目前，体外评估由ABC转运体引起的DDI的常用模型为膜囊泡系统、基于极化细胞的双向转运系统和三明治培养肝细胞。在实际应用过程中，我们需综合多方因素，选择合适的试验系统。当进行ABC转运体的体外研究时，以下几点需要关注：

渗透性和吸附：当评估转运体是否为在研药物的底物时，若所测试药物具有高渗透性或强非特异性吸附等特性，可能会因为背景值较高而造成假阴性的结果。如使用膜囊泡研究具有高渗透性活强非特异性吸附的药物，可能会因为被动扩散跨膜进入膜囊泡导致高背景，掩盖转运体介导的药物转运，从而导致在囊泡模型中得到了假阴性的结果。

跨膜能力：如果在研药物分子量大，不易透过细胞膜时，细胞模型将无法研究药物的转运机制，而膜囊泡模型则不受化合物渗透性的影响。药物跨膜能力较差，能够进入到细胞内的游离药物浓度可能较低，而在膜囊泡模型中，药物可以与转运体的结合位点直接接触发挥其作用，并不需要透膜的过程。

辅因子：在设计实验时，应考虑ABC转运蛋白对共底物和辅因子的要求。例如，活细胞中以毫摩尔浓度存在的还原性谷胱甘肽是MRP1、MRP2、MRP2和MRP4转运某些底物所必需的；在某些情况下，谷胱甘肽转运与药物转运有关。因此，试验中需额外添加适量的还原型谷胱甘肽或s -甲基谷胱甘肽。

4.2 SLC转运体研究的关键点

体外评估由SLC转运体引起的DDI的常用模型为单向摄入的细胞系。当使用单向摄入的细胞系统进行摄取研究时，以下几点值得考虑：

溶解度：在试验设计时，应考虑受试物的溶解度。为增加化合物的溶解度，可在不影响细胞活力或转运体功能的情况下添加有机溶剂，如二甲基亚砜。对于溶解度低的化合物，可以在孵育缓冲液中加入白蛋白或其他赋形剂，但需要确定化合物处于未结合浓度，否则数据解释将变得复杂。

试验程序：为保证试验结果的准确性，试验过程需遵循一致的程序，尽量减小试验误差导致的影响。摄取速率通常归一化为细胞总蛋白（mg）或细胞数，以便与亲代或空载体转染细胞的摄取相比，准确测定转运蛋白特异性摄取。

孵育时间：为了确定受试物的抑制作用，需根据受试物特性，如渗透性、是否为转运体底物等，考虑其与抑制剂的孵育时间（预孵育和/或共孵育）。

IPHASE转运体产品

作为体外研究生物试剂引领者，IPHASE以HEK293为载体，成功推出全面匹配指导原则需求的SLC转运体细胞（OATP1B1、OATP1B3、OAT1、OAT3、OCT2、MATE1和MATE2-K）、ABC转运体囊泡（P-gp和BCRP）及配套产品，助力药物转运体介导的DDI研究。

参考资料：

[1]洪梅,王旭阳.药物转运体的翻译后处置及相关关键位点研究进展[J].华南农业大学学报,2022,43(06):160-172.

[2] Brouwer K L R , Keppler D , Hoffmaster K A ,et al.In vitro methods to support transporter evaluation in drug discovery and development.[J].Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2013, 94(1).DOI:10.1038/clpt.2013.81.

[3]《药物相互作用指导原则2020》

IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为食品、药品、化学品等的遗传毒性研究提供便捷产品，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线400-127-6686。

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