方案摘要
方案下载| 应用领域 | 农/林/牧/渔 |
| 检测样本 | 畜牧 |
| 检测项目 | 动物疫病>牛病, 猪病, 其他 |
| 参考标准 | GBT18648-2020dz |
包被酶标板 用包被缓冲液将ASFV P30重组蛋白稀释至终浓度0.3μg/ml,每孔100μL包被96孔酶标板奇数条作为检测孔,使用抗原稀释液包被96孔酶标板偶数条作为对照孔,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。
猪瘟间接ELISA抗体检测步骤
猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感,且表现出相似的临床症状和死亡率;而非洲野猪,例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是病毒的储存宿主。
一、实验试剂
1、包被抗原:杆状病毒表达的ASFVP30重组蛋白。
2、酶标抗体:辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗。
3、对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清
4、包被缓冲液--0.05 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液
（配制方法： Na2CO3 0.318g；NaHCO3 0.588 g；去离子水200 mL 用0.22m膜过滤除菌,室温保存备用。）
5、 封闭缓冲液(含2%BSA的pH7.4PBS )
（配制方法： pH7.4 PBS 1 000 ml ；BSA 20 g；现配现用）
6、稀释缓冲液(含1%BSA的pH7.4 PBS)
（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；BSA 10 g 现配现用）
6、 洗涤缓冲液--PH7.4PBST(0.05%吐温-20)
（配制方法：pH7.4 PBS 1 000 mL；吐温-20 0.5 ml 现配现用）
7、 TMD底物溶液
（配制方法：底物溶液A:TMB 200 mg；无水乙醇 100 mL；蒸馏水加至1000ml。 底物溶液B:磷酸氢二钠(NazHPO4:,分析纯) 71.7 g；柠檬酸(C6H8O7,,分析纯)9.33 g；0.75%过氧化氢尿素 6.4 mL；加蒸馏水至1000 m,调整pH值至 5.0~5.4。将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用）
8、终止液(2 mol/1 硫酸)
（配制方法：111m分析纯浓硫酸缓慢逐滴加入889m去离子水中,室温分装保存）
二、仪器设备
1、酶标仪。
2、恒温孵育箱。
3、洗板机或洗涤瓶。
4、96孔酶标板。FDT-CIH-F8T
5、96孔U型底孔板1块 ICF-PS-96U-S
6、24道多功能移液工作站（十二板位）FDT-M24-12-300
7、4道储液槽60ml 1个 RES-60-4
8、封板膜 FDT-CP30
9、200μl吸头一盒 PE-200A-1-TSF
三、试验程序
包被酶标板
用包被缓冲液将ASFV P30重组蛋白稀释至终浓度0.3μg/ml,每孔100μL包被96孔酶标板奇数条作为检测孔,使用抗原稀释液包被96孔酶标板偶数条作为对照孔,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300μL/孔加入封闭缓冲液,37℃饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干。
四、实验步骤（图片仅为实验模拟图）
第一步：
用移液工作站将待检血清与阴性、阳性对照血清使用样品稀释液做40倍稀释。
第二步：
酶标板上对照和待检样品的分布图,见下图。50μL/孔,在A1、A2和B1、B2孔中加入稀释后的阳性对照血清,在 C1、C2和 D1、D2孔中加入稀释后的阴性对照血清,在E1、E2等其余孔加入稀释后的待检血清,37℃孵育60min。
样品加样记录表
1 | 2 | 3 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | P | P | |||||||||
B | P | P | |||||||||
C | N | N | |||||||||
D | N | N | |||||||||
E | |||||||||||
F | |||||||||||
G | |||||||||||
H |
说明：
P为阳性对照
N为阴性对照
空白为待检样品孔
第三步：
弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔。
第四步：
每孔加入酶标抗体(1x),50μL/孔,37℃孵育30 min。
第五步：
弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300μL/孔
第六步：
每孔加入底物溶液,50μL/孔，室温避光作用10min。
第七步：
每孔中加入50μL终止液,终止反应。
第八步：
用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值,按下列算式计算OD450差值。OD450-c=OD450-J-OD450-O
式中:
OD450-c——OD450差值;
OD450-J——OD450奇数孔值;
OD450-O ——OD450偶数孔值。
文献贡献者
关于生活饮用水样本自动计测滤膜总大肠菌群数量的应用
fluidot蠕动泵分液器在生活饮用水耐热大肠菌（多管发酵法）检测中的应用
关于fluidot自动液体分装仪在生活饮用水总大肠菌群检测中的应用
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