供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T |
货号: | BES20709BO |
CAS号: |
产品概述
高尔基体膜蛋白提取试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的高尔基体膜蛋白的提取。 本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。 本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。 本试剂盒中不含有EDTA,与金属螯和层析等下游应用兼容。
保存温度
2-8℃
注意事项
1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完!
有效期
一年
检测方法
WB,IP等
适用样本
动物细胞/组织
产品特点
1.使用方便,从细胞,组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便。
3.含蛋白稳定剂,提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时,背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分,可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白,又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解,蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64,每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性,包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
产品应用
WB,IP等
仪器准备
1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
试剂准备
1.PBS缓冲液
2.蛋白定量试剂盒
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
使用注意事项:
旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
最hao使用Dounce匀浆器匀浆,如果没有Dounce匀浆器,也可用普通玻璃匀浆器匀浆,但是高尔基体蛋白回收率会下降。
用Dounce匀浆器匀浆是高尔基体膜蛋白提取的关键的步骤,故匀浆前最hao先通过预实验确定不同组织样本的最适匀浆次数,方法是每匀浆 5-10 次后,取 2-3 μl 匀浆液到载玻片上,然后在相差显微镜下观察,完整细胞数量降低到 20%以下为佳。此镜检步骤非必须步骤,但是会影响高尔基体膜蛋白的回收率。在样本极难获取的实验中,务必做镜检。
提取液C在使用前须一直置于2-8℃条件,否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
膜蛋白电泳时loading buffer应该避免煮沸。
膜蛋白电泳时可以提高loading buffer的SDS含量。
使用方法
细胞高尔基体膜蛋白提取:
1. 提取液制备:
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取1-2×107个细胞,在4℃,500×g条件下离心2-3分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入500 μl冷的试剂 A,置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器匀浆充分匀浆。
6. 然后在4℃,1000×g力条件下离心5分钟。
7. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃,3000×g力条件下离心10分钟。
9. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
10. 在4℃,10000×g力条件下离心10分钟。
11. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
12. 在4℃,25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。
13. 在沉淀中加入400 μl冷的试剂B,混匀。
14. 在4℃,25000×g力条件下离心30分钟。
15. 弃上清,沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C,充分混匀。
16. 在2-8℃条件下振荡30-40分钟,至沉淀充分裂解,无明显沉淀。
17. 在4℃,12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀,收集上清。
18. 将上清吸入另一干净离心管,在37℃水浴10分钟。
19. 在37℃,1000×g力离心5分钟,此时溶液分为两层,下层是膜蛋白约为20-30μl。
20. 小心移除上层液体,收集上层部分留作备用分析。
21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分,即得高尔基体膜蛋白。
22. 将高尔基体膜蛋白样品,置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织高尔基体膜蛋白提取:
1. 提取液制备:
每200 μl冷的蛋白提取液C中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
每200 μl冷的蛋白提取液D中加入1 μl蛋白酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取50-100 mg新鲜动物组织样本,用PBS洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎,用冷PBS洗涤两次。
4. 加入500 μl冷的试剂 A,置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆30-40下,至无明显固体团块。
6. 然后在4℃,1000×g力条件下离心5分钟。
7. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃,3000×g力条件下离心10分钟。
9. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
10. 在4℃,10000×g力条件下离心10分钟。
11. 弃沉淀,将上清吸入另一预冷的干净离心管。
12. 在4℃,25000×g力条件下离心30分钟。弃上清。
13. 在沉淀中加入400μl冷的试剂B,混匀。
14. 在4℃,25000×g力条件下离心30分钟。
15. 弃上清,沉淀中加入100-200 μl冷的蛋白提取液C,混匀。
16. 在4℃条件下振荡30-40分钟,至沉淀充分裂解,无明显沉淀。
17. 在4℃,12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀,收集上清。
18. 将上清吸入另一干净离心管,在37℃水浴10分钟。
19. 在37℃,1000×g力离心5分钟,此时溶液分为两层,下层是膜蛋白约为20-30μl。
20. 小心移除上层液体,收集上层部分留作备用分析。
21. 用50-100 μl冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层高尔基体膜蛋白部分,即得高尔基体膜蛋白。
22. 将高尔基体膜蛋白样品,置冰箱备用或直接用于下游实验。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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