供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/48S |
货号: | BES-2156BTK |
CAS号: |
异柠檬酸裂解酶(ICL)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 提取液:临用前将试剂七加入到提取液中,勿放于-20℃;
2、 试剂三:临用前取 1 瓶加入 6.25mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前取 1 瓶加入 6.6mL 蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂-20℃分装保存 2 周,避免反复冻融;
4、 试剂五:使用前需先离心。根据用量按照试剂五:蒸馏水为 1:8 的体积比例充分混匀,现用现配;
5、 工作液配制:按试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=145:175:210:210:15 的比例将各试剂混合后备用(共 755μL,1T 的量),根据样本数量现用现配。
产品说明:
ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在340nm下有特征吸收峰,监测340nm吸光度的减小速率可间接反应ICL活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织处理:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 样本测定
将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中,加试剂六的同时开始计时,在 340nm 波长下记录 10 秒时的初始吸光度 A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中准确反应 2分钟;迅速取出比色皿并擦干,340nm 下比色,记录 2 分 10 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。
三、ICL 活性计算
1、组织中ICL活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
(2)按样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。ICL(U/g 质量)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(W÷V提取×V样本) ÷T=2297×ΔA÷W
V反总:反应总体积,1.0×10-3L;V样本:加入样本体积,0.035mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:1mL石英比色皿光径,1cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;T:
反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
2、细菌或培养细胞中ICL活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/mg prot)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(V样本×Cpr) ÷T=2297×ΔA÷Cpr
(2)按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
ICL(U/104 cell)=ΔA ÷(ε×d)×V反总×109÷(500÷V提取×V样本) ÷T=4.59×ΔA
V反总:反应总体积,1.0×10-3L;V样本:加入样本体积,0.035mL;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:1mL石英比色皿光径,1cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V提取:加入提取液体积,1mL;500:细菌或细胞数量,500万;T:反应时间,2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、 比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水,将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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