供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2163BTK |
CAS号: |
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格: 50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
产品说明:
线粒体异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,ICDHm),广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,与线粒体基因表达及线粒体其他的功能有关。异柠檬酸脱氢酶在生物体内有两种存在形式,以NAD为辅酶的NAD-依赖型异柠檬酸脱氢酶,和以NADP为辅酶的NADP-依赖型异柠檬酸脱氢酶。异柠檬酸脱氢酶的主要功能,是在体内三羧酸循环中,催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,将NAD还原成NADH,通过测定α-酮戊二酸的生成量,可以计算出线粒体异柠檬酸脱氢酶活力高低。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
低温离心机、可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1.称取约 0.3g 组织或收集 1500 万细胞,加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2.4℃,1000g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。
3.上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的异柠檬酸脱氢酶(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4.在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二,超声波破碎(功率 40%,超声 5 秒,间隔 9 秒,4min),4℃,10000g 离心 10 min,取上清液用于线粒体异柠檬酸脱氢酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min以上,调节波长至505nm,蒸馏水调零。
2、 将标准品用提取液三稀释至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL标准溶液。
3、 操作表(在1.5 mLEP管中进行如下操作):
三、ICDHm活性计算
1、标准曲线绘制:
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA带入方程得到x(μmol/mL)。
2、酶活力计算:
酶活定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。
ICDHm酶活力(U/mg prot)=x×V上清÷(Cpr×V上清)÷T×103=x÷Cpr×16.67V上清:加入上清液体积,0.2mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,需自行测定;T:反应时间,1h=60min;103:单位换算系数,1μmol =103nmol。
注意事项:
1、 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1),可用提取液三稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。
2、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
3、 附:使用样本重量计算公式
A、上清(胞浆)中ICDHm活力计算:
按样本质量计算
酶活定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(U/g 质量)=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×103=25.25×x÷W
V提取:加入提取液体积,1.515mL;V样:加入上清液体积,0.2mL;W:样本质量,g;T:反应时间,1h=60min;103:单位换算系数,1μmol =103nmol。
B、沉淀(线粒体)中ICDHm活力计算:
按样本质量计算
酶活定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol α-酮戊二酸定义为一个酶活性单位。
ICDHm活性(U/g 质量)=x×V样÷(W×V样÷V提取)÷T×103=10.1×x÷W
V提取:沉淀重悬时加入提取液体积,0.606mL;V样:加入上清液体积,0.2mL;W:样本质量,g;T:反
应时间,1h=60min;103:单位换算系数,1μmol =103nmol。
C、样本ICDHm总活力计算:
样本ICDHm总活力即为上清(胞浆)中ICDHm活力与沉淀(线粒体)中ICDHm活力之和。
按样本质量计算:ICDHm(U/g 质量)=25.25×x÷W+10.1×x÷W
实验实例:
1、 取 0.3g 小鼠肾脏加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃,1000g 离心 10min。
将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物,在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二,超声波破碎,4℃,10000g 离心 10min,取上清液,分别按操作步骤检测,测得:胞浆 ΔA测定=A 测定管-A 对照管=0,线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.767-0.475=0.292,带入标准曲线y=1.0917x+0.0471 计算相应的 x 值,按样本质量计算酶活得:胞浆中 ICDHm 活性(U/g 质量)=25.25×x÷W=0U/g 质量,线粒体中 ICDHm 活性(U/g 质量)=10.1×x÷W=7.55 U/g 质量,样本总 ICDHm(U/g 质量)
=25.25×x÷W+10.1×x÷W=7.55 U/g 质量。
2、 取 0.3g 小化眉加入 1.5mL 提取液一和 15μL 提取液二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。4℃,1000g 离心 10min。
将上清液移至另一离心管中,4℃,11000g 离心 15min。上清液即胞浆提取物,上清液稀释 2 倍,在沉淀中加入 600μL 提取液三和 6μL 提取液二,超声波破碎,4℃,10000g 离心 10min,取上清液稀释 2 倍,分别按操作步骤检测,测得:胞浆 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0,线粒体 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.635-0.487=0.148,带入标准曲线 y=1.0917x+0.0471 计算相应的 x 值,按样本质量计算酶活得:胞浆中 ICDHm 活性(U/g 质量)
=25.25×x÷W×2=15.49U/g 质量,线粒体中 ICDHm 活性(U/g 质量)=10.1×x÷W×2=2.28 U/g 质量,样本总 ICDHm
(U/g 质量)=25.25×x÷W×2+10.1×x÷W×2=15.49 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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