供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 10T/9S |
货号: | BES-2179BTK |
CAS号: |
酰基转移酶(AAT)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:10T/9S、25T/24S、50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
产品说明:
AAT是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇,同时还原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰,测定412nm吸光度增加速率,来计算AAT活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织样本:称取约 0.1g 样本加提取液 1mL,冰上充分研磨,15000g 4℃离心 20min,上清液待测。血清(浆)样本:直接检测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至412nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一在37℃水浴保温20min以上。
3、 样本测定:
将上述试剂按顺序加入 1mL 玻璃比色皿中,加试剂四的同时开始计时,在 412nm 波长下记录 10s 时的初始吸
光度 A1 和 130s 后的吸光值 A2,计算 ΔA 空=A2 空-A1 空;ΔA 测=A2 测-A1 测,ΔA=ΔA 测-ΔA 空。
三、AAT活性计算
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:37℃中每mL反应体系下每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/mg prot) =ΔA÷0.001÷(Cpr×V样) ÷T=5000×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按样本质量计算
单位的定义:37℃中每mL反应体系下每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/g 质量) =ΔA÷0.001÷(V样÷V样总×W) ÷T=5000×ΔA÷W
3、按血清浓度计算
单位的定义:37℃中每mL反应体系下每mL血清每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。
AAT (U/mL 血清) =ΔA÷0.001÷V样÷T=5000×ΔA
Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL;V样:加入反应体系中上清液体积,0.1mL;W:样本质量,g;V样总:提取液体积,1mL;T:反应时间,2min。
注意事项:
1、 上清液蛋白质含量需要另外测定。
2、 当吸光值大于1时,建议稀释后测量。
3、 如果ΔA测偏低,可以延长反应时间,如测定10s和310s的吸光度,相应修改计算公式中反应时间。
实验实例:
1、 取0.1g肾脏加入1mL提取液进行样本处理,取上清后稀释4倍后按测定步骤操作,测得ΔA空=A2空-A1空=0.105-
0.101=0.004、ΔA测=A2测-A1测=0.665-0.479=0.186、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.186-0.004=0.182,按样本质量计算酶
活得:
AAT (U/g 质量) =5000×ΔA÷W×4(稀释倍数)=36400 U/g 质量。
2、 取兔血清直接按照测定步骤操作,测得ΔA空=A2空-A1空=0.105-0.101=0.004、ΔA测=A2测-A1测0.622-
0.521=0.101、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.101-0.004=0.097,按血清体积计算酶活得:
AAT (U/mL 血清) =5000×ΔA=5000×0.097=485 U/mL 血清。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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