供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2193BTK |
CAS号: |
β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂一:临用前每瓶加入 10 mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融;
2、标准品:5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
β-GC(EC 3.2.1.21)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化β-糖苷键水解,具有多方面生理作用:在纤维素的糖化作用中,β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖;β-GC水解萜烯类香气前驱体,使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味;β-GC能够水解植物体内野黑樱苷,释放HCN,从而防止昆虫取食。
β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或培养细胞的处理:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 1000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000g,4℃条件下离心 20min,取上清,置冰上待测。
2、组织的处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.2g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g,4℃条件下离心 20min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释:临用前将 5 μmol/mL 标准液稀释至 100、50、25、12.5、6.25、0 nmol/mL 标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表:
三、β- GC 活力单位的计算
1、标准曲线建立:
根据标准管的浓度(x,nmol/mL)和吸光度(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA(y,ΔA测定)带入公式计算样本产物浓度x(nmol/mL)。
2、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
3、按样本质量计算
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC活力(U/g 质量) =(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W
4、按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GC活力(U/104 cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需要另外测定;V反总:反应体系总体积,1mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000万;T:反应时间,0.5h。
注意事项:
提取液中含有使蛋白变性的成分,故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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