供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2197BTK |
CAS号: |
酸性木聚糖酶(ACX)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂一:临用前加入 12mL 蒸馏水使用,2-8℃保存 3 个月。
2、标准品:10mg 木糖。临用前加入 667μL 缓冲液配成 100μmol/mL 的标准品溶液,2-8℃保存 8 周。
产品说明:
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生,能催化水解木聚糖,也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶,可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖,降低酿造中物料的粘度,促进有效物质的释放,以及降低饲料中的非淀粉多糖,促进营养物质的吸收利用,因而广泛的应用于酿造和饲料工业中,酸性木聚糖(ACX)一般分离自耐酸的真菌,细菌及部分霉菌。
ACX 在酸性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖,进一步在沸水浴条件下与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应,在 540nm 处有特征吸收峰,反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,通过测定反应液在 540nm吸光值增加速率,可计算 ACX 活力
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
天平、低温离心机、恒温水浴锅,可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移液枪、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 发酵液:发酵液于 8000rpm,4℃,离心 15min,取上清,作为待测样本。
2. 酶干粉:称约 1mg,加 1mL 缓冲液溶解,蒸馏水稀释 10 倍待测。
3. 组织样本:称约 0.1g 组织,加入 1mL 缓冲液,冰上充分研磨。8000rpm,4℃,离心 15min,取上清蒸馏水稀释 10 倍待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度预热30min 以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2、 标准品稀释:取20μL 100μmol/mL木糖标准液,加入980μL缓冲液,充分混匀,配制成2μmol/mL的木糖标准液备用,现用现配。(实验中每管需要200μL,为减小实验误差,故配制大体积。)
3、 样本测定:(在EP管中加入下列试剂)
三、ACX活性计算
1、发酵液 ACX 活力计算:
酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每毫升发酵液每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力(U/mL)= C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷T
= 0.067×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)
C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mL;T:反应时间,30min。
2、酶干粉 ACX 活力计算:
酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每毫克酶每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力(U/mg)= 10×C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 提取÷W1÷T
= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W1
10:样本稀释倍数,10 倍;C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mL;V 提取:加入缓冲液体积,1mL;W1:酶干粉重量,mg;T:反应时间,30min。
3、组织中 ACX 活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:50℃,pH 4.8 条件下,每 mg 组织蛋白每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚糖酶的活力单位。
ACX 活力(U/mg prot)= 10×C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 样本÷(V 样本×Cpr)÷T
= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷Cpr
(2)按样本质量计算:
酶活定义:50℃,pH4.8 条件下,每克组织每分钟分解木聚糖产生 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酸性木聚
糖酶的活力单位。
ACX 活力(U/g 质量)= 10×C 标准×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)×V 提取÷W2÷T
= 0.67×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W2
10:样本稀释倍数,10 倍;C 标准:木糖标准溶液浓度,2μmol/mL;V 提取:加入缓冲液体积,1mL;W2:样本质量,g;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V 样本:加入的样本量,0.2mL。
注意事项:
吸光度变化应该控制在 0.01~1.2 之间,否则加大样本量或稀释样本,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
实验实例:
1. 取 0.1g 草莓加入 1mL 缓冲液进行匀浆研磨,取上清用缓冲液稀释二十倍后按照测定步骤操作,测得 A 测定
=0.927、A 对照=0.875、A 标准=0.852、A 空白=0.160,按样本质量计算酶活得:
ACX 活力(U/g 质量)=0.067×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W2=1.0069 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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