供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/48S |
货号: | BES-2200BTK |
CAS号: |
果胶裂解酶(PL)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
规格: 50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
试剂一:溶液中如果有沉淀存在,可以 50℃水浴助溶。
产品说明:
果胶裂解酶(EC4.2.2.10)是果胶酶的重要组成部分,催化果胶分子链的消除裂解。来源比较广泛,主要来源于微生物,在食品加工工业中提高果汁产量方面有重要意义,在减少环境污染和降低能源消耗方面也具有潜在的应用价值。
果胶裂解酶作用于果胶中的α-1,4糖苷键,生成在还原端C4和C5之间位置具有不饱和键的不饱和寡聚半乳糖醛酸,在235nm处有特征吸收峰,测定235nm下吸光度的上升来表示果胶裂解酶的活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、恒温水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液:直接测定。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 235nm,蒸馏水调零。
2、 操作表:(在 1.5mL 离心管中)
三、果胶裂解酶活性计算
1. 按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每毫克蛋白每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×Cpr)÷T=64.1×ΔA÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每克组织每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×W÷V 样总)÷T= 64.1×ΔA÷W
3. 按照细菌、真菌数量计算
酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每 104个细胞每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性(U/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷(V 样×细胞数量÷V 样总)÷T= 64.1×ΔA÷细胞数量
4. 按照培养液体积计算
酶活性定义:在 40℃,pH5.5 条件下,每毫升培养液每分钟分解果胶产生 1nmol 不饱和半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
PL 活性(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总×109÷V 样÷T= 64.1×ΔA
ε:不饱和半乳糖醛酸摩尔消光系数:5200 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.001L;V样:反应体系中样本体积,0.1mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,30min;109:换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 若 ΔA 大于 0.5,将粗酶液用蒸馏水稀释后再进行测定。若 A 测定管大于 1.5 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2、 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3、 空白管正常情况下变化不超过 0.02。
实验实例:
1、 取 0.1g 香蕉皮加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定管= A2 测定-A1 测定=0.43-0.421=0.009,按样本质量计算酶活得:
PL 活性(U/g 质量)= 64.1×ΔA÷W=5.526 U/g 质量。
2、 取适量大肠杆菌(500 万)加入 1mL 提取液冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定管=A2 测定-A1
测定=1.352-0.923=0.429,按照细菌、真菌数量计算:
PL 活性(U/104 cell)= 64.1×ΔA÷细胞数量=263.4 U/104 cell。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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