供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2201BTK |
CAS号: |
滤纸酶(FPA)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1. 滤纸条:常温防潮保存。
2. 标准品:10mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解,配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用,2-8℃保存两周。
产品说明:
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖一类酶的总称,它不是单体酶,而是起协同作用的多组分酶系。以不溶性纤维素如滤纸为底物测定的纤维素酶称为滤纸酶,研究滤纸酶活力对纤维素酶总体酶活力的研究的有着重要意义。
FPA 水解滤纸产生还原糖,还原糖与 3,5 -二硝基水杨酸反应生成在 540 nm 有特征吸收峰的棕红色物质,通过测定 540 nm 处吸光值变化可计算得 FPA 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1 mL 玻璃比色皿、超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管(2 mL)。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照质量(g)﹕蒸馏水体积(mL)为 1﹕5~10 的比例(建议称取约 0.1 g,加入 1 mL 蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于 4℃,12000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞或细菌:先收集细胞或细菌到离心管中,离心后弃上清;按照细胞或细菌数量(104个)﹕蒸馏水体积(mL)为 500~1000﹕1 的比例(建议 500 万细胞或细菌加入 1 mL 蒸馏水),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3 min);然后 4℃,12000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体:直接检测。(若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定)
二、测定步骤
1、 分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 540 nm,蒸馏水调零。
2、 将 10 mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 mg/mL 的标准溶液备用。
3、 标准品稀释表
实验中每个标准管需200μL标准溶液。
4、 取 200 μL 样本沸水浴 10 min(盖紧,防止水分散失),放置常温后作为对照管。
5、操作表:(在 2 mL 离心管中操作,其中对照管与测定管用有滤纸的 EP 管,空白管与标准管无需滤纸)
三、FPA 活性计算
1、 标准曲线的绘制:
根据标准管的浓度(x,mg/mL)和吸光度ΔA标准(y,ΔA标准),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA测定(y,ΔA测定)带入公式计算样本浓度(x,mg/mL)。
2、 FPA 活性的计算:
(1) 按蛋白浓度计算
酶活定义:每 mg 蛋白每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
FPA 酶活(U/mg prot)=x×V 提取÷(V 提取×Cpr)÷T=0.0333x÷Cpr
(2) 按样本质量计算
酶活定义:每 g 样品每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
FPA 酶活(U/g 质量)=x×V 提取÷W÷T=0.0333x÷W
(3) 按照细胞或细菌数量计算
酶活定义:每 104 个细胞每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
FPA 酶活(U/104 cell)=x×V 提取÷细胞数量(万个)÷T=0.0333x÷细胞数量(万个)
(4) 按液体体积计算
酶活定义:每 mL 样本每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。
FPA 酶活(U/mL)= x×V 样÷V 样÷T=0.0333x
V 提取:提取液(蒸馏水)体积,1 mL;V 样:加入的样本体积,0.2 mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;T:反应时间,30 min。
注意事项:
1. 用干净的镊子取出滤纸条,带手套将滤纸条卷成小卷放入 EP 管底部。
2. 当 A 或 ΔA 超过 1.2 时,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。
3. 显色结束吸取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条,以免带入毛状物,影响测定结果。
实验实例:
1、 取 0.1g 平菇伞部加入 1mL 蒸馏水,冰浴匀浆后于 4℃,12000 rpm 离心 10 min,取上清置于冰上待测。之后按照测定步骤操作,测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.668-0.425=0.243,带入标准曲线 y=1.6716x-0.2189,计算 x=0.2763,按样本质量计算酶活得:
FPA 酶活(U/g 质量)=x×V 提取÷W÷T=0.0333x÷W=0.092 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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