供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 25T/24S |
货号: | BES-2231BTK |
CAS号: |
线粒体复合体Ⅱ活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
规格:25T/24S、50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
25T 溶液的配制:
1、 试剂二:溶于 1 mL 丙酮,可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用。
2、 试剂三:临用前加入 2 mL 丙酮溶解备用。
3、 工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三按 1:1 混合,现用现配。50T 溶液的配制:
1、试剂二:溶于 1 mL 丙酮,可分装后-20℃保存。临用前再用丙酮 100 倍稀释后使用。
2、试剂三:临用前加入 3 mL 丙酮溶解备用。
3、工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三按 1:1 混合,现用现配。
产品说明:
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1.0mL 提取液,用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
2、 4 ℃ 600g 离心 10min。将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000g 离心 15min。
3、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4、 在沉淀中加入 400μL 提取液,超声波破碎(功率 20%,超声 5 秒,间隔 10 秒,重复 15 次),用于复合体Ⅱ酶活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计预热30min 以上,调节波长至605nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)预热15min。
3、 在1mL玻璃比色皿中分别加入:
三、复合体Ⅱ活力单位的计算
按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=476.2×ΔA÷Cpr
V反总:反应体系总体积,10-3L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1、 为保证实验结果的准确性,需先取 1-2 个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于 1.5),可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若 ΔA 大于 0.4,需将样本稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数);若 ΔA 偏小,则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
2、 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
3、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4、 本试剂盒试剂足够完成 50 管反应。
5、 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为 50T/24S)
A、上清中复合体II活力的计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体II活性(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本))÷T=476.2×ΔA1÷W
ΔA1:上清测定值;V反总:反应体系总体积,10-3L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V提取:加入提取液体积,1mL;V样:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,2min;W:样本重量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B、沉淀中复合体II活力的计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体II活性(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本))÷T=190.5×ΔA2÷W
ΔA2:沉淀测定值;V反总:反应体系总体积,10-3 L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V提取:沉淀重悬体积,0.4mL;V样:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,2min;W:样本重量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
C、样本复合体II总活力的计算:
样本复合体II总活力即为上清中复合体II活力与沉淀中复合体II活力之和。
复合体II(U/g 质量)=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W
实验实例:
1. 取 0.1g 兔子肝脏样本加入 1mL 提取液进行匀浆研磨离心,按照测定步骤操作,测得上清中 ΔA1=A1-A2=1.134-1.054=0.08,沉淀中 ΔA2=A1-A2=1.371-1.347=0.024,则按样本质量计算得:
上清中复合体 II 活性(U/g 质量)=476.2×ΔA1÷W=476.2×0.08÷0.1=380.96 U/g 质量
沉淀中复合体 II 活性(U/g 质量)=190.5×ΔA2÷W =190.5×0.024÷0.1=45.72 U/g 质量
复合体 II(U/g 质量)=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W =476.2×0.08÷0.1+190.5×0.024÷0.1=426.68 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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