供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 25T/24S |
货号: | BES-2236BTK |
CAS号: |
结合态淀粉合成酶(GBSS)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:25T/24S、50T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂四:临用前每支加入 5 mL 试剂一。
2、 试剂五:临用前每支加入 8 mL 试剂一。
3、 试剂六:临用前取 1 支加入 208 μL 双蒸水,充分溶解备用,用不完的试剂 4℃保存。
4、 试剂八:每支临用前加入溶解好的 4 mL 试剂四。
5、 反应液Ⅰ的配制:临用前在试剂二中加入 7 mL 试剂一,缓慢加热,逐渐升温使其溶解,冷却后加入试剂三混合溶解,这样可以分两批配制并且测定。
产品说明:
GBSS(EC 2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中,催化淀粉链的加长反应,主要负责直链淀粉的合成。
GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成ADP;进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH,其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比,通过340nm下测定NADPH的增加量,可以计算GBSS活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液,冰浴中匀浆。10000g ,4℃离心 10min,弃上清,在沉淀中加入 1mL 提取液充分混匀,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 在EP管中按顺序加入下列试剂
注意:试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。
三、GBSS 活性计算
1、按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS活性(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(Cpr×V样÷V反总×V上清) ÷T =43.2×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
2、按照样本质量计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS活性(U/g 质量)=[ΔA÷(ε×d)×V测]÷(W÷V提取×V样÷V反总×V上清) ÷T=43.2×ΔA÷W
V测:测量体积,0.78mL;V反总:反应体积,0.62mL;V提取:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,20min;ε:NADPH消光系数,6.22×10-3mL/(nmol˙cm);d:石英比色皿光径,1cm;V样:加入样本的量,0.2mL;V上清:吸取上清液的量,0.45mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
实验实例:
1、 取0.1g肝脏加入1mL提取液,冰浴中匀浆。10000g,4℃离心10min,弃上清,在沉淀中加入1mL提取液充分混匀,置冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A2-A1=0.19-0.178=0.012,按样本质量计算:
GBSS活性(U/g 质量)=43.2×ΔA÷W=5.184 U/g 质量。
2、 取0.1g柳树加入1mL提取液,冰浴中匀浆。10000g,4℃离心10min,弃上清,在沉淀中加入1mL提取液充分混匀,置冰上,之后按照测定步骤操作,测得计算ΔA=A2-A1=1.919-1.915=0.004,按样本质量计算:
GBSS活性(U/g 质量)=43.2×ΔA÷W=1.728 U/g 质量。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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