供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 50T/24S |
货号: | BES-2242BTK |
CAS号: |
糖原磷酸化酶 b (GPb)活性检测试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品内容:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、 试剂二:临用前加入 1.25 mL 蒸馏水,充分混匀;2-8℃保存 2 个月;
2、 试剂三:临用前加入 1.25 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
3、 试剂四:临用前加入 1.25mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
4、 试剂五:临用前每支加入 1 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
5、 试剂六:临用前每支加入 1 mL 蒸馏水,充分混匀;可分装后-20℃保存 4 周,避免反复冻融;
6、 试剂七:临用前加入 4 mL 蒸馏水,充分混匀后-20 分装保存 4 周,避免反复冻融;
7、 工作液的配制:临用前根据实验所需用量,按照试剂一:试剂二:试剂三:试剂四 =740μL: 20μL:
20μL: 20μL(1T 的量)的比例,充分混匀,现用现配。
产品说明:
糖原磷酸化酶是糖原分解代谢中的关键酶,催化糖原的磷酸化反应。该酶分为有活性的糖原磷酸化酶 a(Glycogen phosphorylase a, GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(Glycogen phosphorylase b, GPb)两种形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下进行。未添加激活剂时,糖原磷酸化酶 a 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH,在 340nm 下测定 NADPH 上升速率,即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。添加激活剂测定 GP(GPa 和 GPb)总活性,未添加激活剂时测定 GPa 活性,GP 活性-GPa 活性得到 GPb 活性。
在 340nm 下测定 NADPH 上升速率,即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、电子天平、可调式移液器、研钵/匀浆器、1 mL 石英比色皿、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为 1︰5~10 的比例(建议称取约 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 8000 g,4℃,离心 10 min,取上清置于冰上待测。
2、血清(浆):直接检测。若有浑浊可以离心后取上清进行测定。
3、细菌或者细胞:先收集细胞或细菌样本到离心管内,弃上清,按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次)。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热 30 min 以上,调节波长至 340 nm,蒸馏水调零。
2、 工作液置于 37℃预热 5min。
3、 GPa 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 蒸馏水、800 μL 工作液,立即混匀并计时,记录 340 nm 下 10s 时吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGPa=A2-A1。
4、 GP 活性:在石英比色皿中依次加入 50 μL 样本、50 μL 试剂五、50 μL 试剂六、50 μL 试剂七、800 μL 工作液,立即混匀并计时,记录 340 nm 下 10s 时吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2。计算 ΔAGP=A4-A3。
三、 糖原磷酸化酶 b (GPb)活性计算
注意事项:
1、如果测定吸光值 ΔA>0.8,建议稀释样本后再测定,计算公式中乘以稀释倍数;如果测定吸光值较低或接近空白 OD 值,建议增加反应中的样本体积或者样本质量后再进行测定。
实验实例:
1、 称取 0.1 g 兔子肝脏组织,加入 1 mL 提取液,冰浴匀浆,8000 g,4℃条件下离心 10 min;取上清置于冰上待测。按照测定步骤操作,用石英比色皿比色后计算 ΔAGPa=A2-A1=0.414-0.318=0.096,ΔAGP=A4-A3= 0.434-0.320=0.114,按公式计算活性:
GPb(U/g 鲜重)=321.54×(ΔAGP-ΔAGPa) ÷W =321.54×(0.114-0.096)÷0.1 =57.87U/g 鲜重
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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