供货周期: | 一周 |
品牌: | 博尔森 |
规格: | 100T/48S |
货号: | BES-2271BTK |
CAS号: |
辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒说明书
微量法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:100T/48S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
溶液的配制:
1、试剂三:需要严格避光;
2、试剂六:19.2 mL 乙醇和 0.8 mL 蒸馏水混合,备用;
3、NAD 标准品:临用前加入 1.5 mL 蒸馏水,即 2 μmol/mL,将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用;
4、NADH 标准品:临用前加入 1.4 mL 蒸馏水,即 2 μmol/mL,将其稀释为 1.25 nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。
产品说明:
辅酶 I 包括还原型和氧化型两种形式,在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶 I 又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是脱氢酶的辅酶,它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给 NAD,使之成为 NADH(还原型辅酶 I)。而 NADH 则会作为氢的载体,在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式,合成 ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义,与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶 I 含量降低会导致细胞损伤或衰亡。分别用酸性和碱性提取液提取样本中NAD+和NADH,NADH通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲瓒,在 570nm 下检测吸光值,而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
混匀,取 200μL 至微量玻璃比色皿或酶标板中, 570nm 下比色,读取吸光值 ΔA=A 测定管-A 对照管,NAD标准管的记为 ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。NADH 标准管的记为 ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。(空白管只需做 1-2 次)
三、NAD+含量的计算
注意事项:
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三混合后再加,必须分开加。
2、反应过程要注意避光。
3、当吸光值大于 1 时,建议稀释后测量。
实验实例:
1、 NAD+的提取:称取约 0.1g 肌肉按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.507-0.2=0.307,ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468,按样本质量计算 NAD+ 含量得:NAD+ (nmol/g 质量)=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W=1.25×0.307÷0.468÷0.1=8.1998 nmol/g 质量。NADH 的提取:称取约 0.1g 肌肉按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.183-0.077=0.106,ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256,按样本质量计算 NADH 含量得:NADH(nmol/g 质量)=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W=1.25×0.106÷0.256÷0.1=5.1758 nmol/g 质量。
2、 NAD+的提取:称取约 0.1g 柳树叶,按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.171-0.101=0.07,ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468,按样本质量计算 NAD+ 含量得:NAD+(nmol/g 质量)=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W=1.25×0.07÷0.468÷0.1=1.8697 nmol/g 质量。NADH 的提取:称取约 0.1g 柳树叶,按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A对照=0.152-0.099=0.053,ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256,按样本质量计算 NADH 含量得:
NADH (nmol/g 质量)=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W=1.25×0.053÷0.256÷0.1=2.5879 nmol/g 质量。
3、 NAD+的提取:取 0.1mL 火鸡血清,按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定= A 测定-A 对照=0.120-0.071=0.049,ΔA 标准 1=A 标准 1-A 空白=0.612-0.144=0.468,按液体体积计算 NAD+ 含量得:NAD+含量(nmol/mL)=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1=12.5×0.049÷0.468=1.3088 nmol/mL。NADH 的提取:取 0.1mL 马火鸡血清,按照提取和测定步骤操作,用 96 孔板测测得计算 ΔA 测定管= A 测定-A对照=0.089-0.065=0.024,ΔA 标准 2=A 标准 2-A 空白=0.399-0.143=0.256,按液体体积计算 NADH 含量得:
NADH 含量(nmol/mL)=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2=12.5×0.024÷0.256=1.1719 nmol/mL。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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